专利名称：通过体细胞胚胎诱导四合木再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及通过体细胞胚胎诱导四合木再生植株的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
四合木(Tetraena mongolica Maxim)，落叶小灌木，强旱生植物，是1. 4亿年前古 地中海孑遗种，属蒺藜科，四合木属，单一种。主要分布于我国内蒙古自治区西部巴彦高勒 至宁夏回族自治区贺兰山东麓的石嘴山之间，多生于石质低山，沙砾质高平原及山前洪积 扇等地，目前仅存有1万公顷左右。四合木以有性生殖为主，但仅有11%的植株能正常开 花，结实率低、胚胎败育率高。而且由于其种子对萌发条件要求苛刻，仅的种子能顺利成 熟、实现繁殖。四合木的生殖特征决定了它繁殖更新速度非常缓慢。此外，近年来，由于过 度放牧和工厂建设中滥垦滥伐，严重破坏了四合木的生存环境，使这一物种种群的面积和 现存数量越来越少、日渐濒危。有专家认为，四合木具有极高的保护和科学研究的价值它的叶和嫩枝中能富集 Fe、Mn、Cu、Zn等多种微量元素；含有生物碱、黄酮类、有机酸类、酚性化合物，可作药用；其 茎中能积累大量油脂，可用作生物能源的原料；研究其茎中大量积累三脂酰甘油的生理生 化基础和分子机理对利用营养器官储存油脂的生物工程具有重要的科学意义。综上所述，研究四合木的快速繁殖技术，扩大其种群、挽救这一濒危植物，已迫在 眉睫。贾玉华等已对扦插繁殖做了研究，5-lOcm的枝条，用ABT处理后，插穗成活率较高。 何丽君等曾对四合木愈伤组织培养、诱导体细胞胚胎等进行过一些研究，初步建立了组织 培养体系，分析了组织培养过程中的一些基本规律。但目前尚未见报道适用于四合木大规 模快速扩繁、通过体细胞胚胎途径诱导再生出完整植株的技术体系。体细胞胚胎的概念源于20世纪初德国植物学家Haberlandt提出的“细胞全能 性”的概念。他预言每个细胞都有在合适的条件下都能形成完整植株的潜力。后来，为了证 实这一论断，许多科学家做了大量实验。经过50余年的不断探索，至1958年，Steward等 将离体培养的胡萝卜脱分化细胞通过体细胞胚胎途径形成完整的再生植株。此后，组织培 养技术迅速发展，通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株在金花茶、枸杞、木瓜、丁香、刺五 加、沙棘等多种灌木中均多有报道，而四合木中则尚未有成熟的体细胞胚胎发生、再生植株 的体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种四合木的胚性愈伤组织诱导培养基。本发明提供的胚性愈伤组织诱导培养基是在1/2MS培养基的基础上添加2-(N_吗 啡啉)乙磺酸(MES)、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO4, AgN03、6-BA、盐酸硫胺素、盐酸吡哆 醇、烟酸、肌醇、碳源和凝胶剂，得到的固体培养基；所述添加的物质在所述胚性愈伤组织诱导培养基中的终浓度是:MES 0. 4-1. Og/ L、水解酪蛋白 450-550mg/L、肌醇 80_120mg/L、活性炭 0. 3-0. 7g/L、CuSO4 20_30mg/L、AgNO3 3-8mg/L、6-BA 0. 5-1. 5mg/L、盐酸硫胺素 0. 5_12mg/L、盐酸吡哆醇 0. 5-1. 5mg/L、烟 酸 0. 5-1. 5mg/L、肌醇 90-110mg/L ；所述1/2MS培养基的溶剂是水，溶质如表2所示。表2、1/2MS培养基的溶质
权利要求
四合木的胚性愈伤组织诱导培养基，是在1/2MS培养基的基础上添加MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO4、AgNO3、6 BA、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、碳源和凝胶剂，得到的固体培养基；所述添加的物质在所述胚性愈伤组织诱导培养基中的终浓度是MES 0.4 1.0g/L、水解酪蛋白450 550mg/L、肌醇80 120mg/L、活性炭0.3 0.7g/L、CuSO4 20 30mg/L、AgNO3 3 8mg/L、6 BA 0.5 1.5mg/L、盐酸硫胺素0.5 12mg/L、盐酸吡哆醇0.5 1.5mg/L、烟酸0.5 1.5mg/L、肌醇90 110mg/L；所述1/2MS培养基的溶剂是水，溶质如表2所示。
2.如权利要求1所述的胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于所述添加的物质在所 述胚性愈伤组织诱导培养基中的终浓度是MES 0. 6g/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇IOOmg/ L、活性炭 0. 5g/L,CuSO4 25. 025mg/L、AgN03 5mg/L、盐酸硫胺素 10mg/L、盐酸吡哆醇 lmg/L、 烟酸 lmg/L、肌醇 100mg/L、6-BA 1. Omg/L。
3.如权利要求1或2所述的胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于所述凝胶剂是琼 脂、卡拉胶或植物凝胶，优选是植物凝胶；所述植物凝胶的终浓度是2-5g/L，优选为3. Og/ L ；所述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖；所述蔗糖的终浓度是25-40g/L，优选 为 30g/L。
4.一种生产四合木再生植株的方法，包括如下步骤1)将切下的四合木的茎诱导，形成愈伤组织；2)将步骤1)得到的愈伤组织接入权利要求1-3中任一所述的胚性愈伤组织诱导培养 基中，形成胚性愈伤组织；3)将步骤2)得到的胚性愈伤组织进行成熟和萌发培养，形成芽，得到所述再生植株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述诱导是将所述切下的四 合木的茎接入愈伤培养基中进行培养的；所述愈伤培养基是在MS培养基的基础上添加2，4-D、6-BA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述2，4-D和6-BA在所述愈伤培养基中的终 浓度是如下a)或b)a)2，4-D0. 15-1. 35mg/L 和 6-BA 0. 05-1. 5mg/L ；b)2,4-D0. 25mg/L 和 6-BA 0. lmg/L ；所述MS培养基的溶剂是水，溶质如表1所示。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法还包括步骤1)和步骤2)之 间的继代培养，所述继代培养是将所述步骤1)得到的愈伤组织接入继代培养基中进行继 代培养；所述继代培养基与所述愈伤培养基相同。
7.如权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于步骤3)中，所述成熟和萌发培养 包括如下步骤将所述步骤2)得到的胚性愈伤组织接入成熟和萌发培养基中培养得到芽； 所述成熟和萌发培养基是在权利要求1-3中任一所述的胚性愈伤组织诱导培养基的基础 上去掉所述活性炭、所述6-BA浓度减半并且添加NAA得到的培养基；所述成熟和萌发培养 基中的NAA终浓度是0. 1-0. 5mg/L，优选是0. 5mg/L。
8.如权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括步骤3)之后的芽 伸长；所述芽伸长包括如下步骤将步骤3)得到的芽插入伸长培养基中进行培养，得到小苗；所述伸长培养基在权利要求1-3中任一所述的胚性愈伤组织诱导培养基的基础上添加 GA3得到的培养基；所述伸长培养基中的GA3终浓度是0. 1-0. 2mg/L，优选是0. lmg/L。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法还包括芽伸长之后的生根培养， 所述生根培养包括如下步骤将所述小苗插入生根培养基中进行生根培养，得到带根的植 株；所述生根培养基是1/2MS培养基的基础上添加MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO4, AgN03、6-BA、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、碳源和凝胶剂，得到的固体培养基；所述添加的物质在生根培养基中的终浓度是MES 0. 4-1. Og/L、肌醇80-120mg/L、IBA 0. 2-0. 5mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇lmg/L、烟酸lmg/L、肌醇100mg/L ；所述1/2MS培养基的溶剂是水，溶质如表2所示。
10.如权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述愈伤培养基、所述继代培养 基和所述生根培养基中的凝胶剂均是琼脂、卡拉胶或植物凝胶，均优选是琼脂；所述琼脂的 终浓度均是5-10g/L，均优选为8. Og/L ；所述愈伤培养基、所述继代培养基和所述生根培养基中的碳源均是葡萄糖、麦芽糖或 蔗糖，均优选为蔗糖；所述蔗糖的终浓度均是25-40g/L，均优选为30g/L。
全文摘要
本发明公开了一种通过体细胞胚胎诱导四合木再生植株的方法。该方法，包括如下步骤1)将切下的四合木的茎诱导，形成愈伤组织；2)将步骤1得到的愈伤组织接入胚性愈伤组织诱导培养基中，形成胚性愈伤组织；3)将步骤2得到的胚性愈伤组织进行成熟和萌发培养，形成芽；4)将步骤3的芽接入伸长、生根培养基中，得到所述完整的再生植株。本研究旨在以四合木愈伤组织为外植体诱导出体细胞胚胎、进而形成再生植株，为建立高效稳定的体细胞胚胎发生系统奠定基础，这对于四合木的快速繁殖、基因工程、遗传转化、遗传改良等方面的研究，都有十分重要的意义。
文档编号A01H4/00GK101953306SQ201010511430
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者吴韩英, 平文丽, 李敏春, 许亦农 申请人:中国科学院植物研究所