专利名称：来源于水稻的miRNA-n3及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及来源于水稻的miRNA-n3及其应用。
背景技术：
miRNA(microRNA,微小RNA)是一类长度约为20_24nt的内源单链非编码小分子 RNA，在生物体中广泛存在(Bartel D P. MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004,116 :281_297.)。近年来大量研究表明，miRNA能够调控生物体 中许多基因的表达，在调节生长发育、细胞增殖、凋亡、抵御环境胁迫等诸多方面发挥重要
(Bushati N, Cohen S Μ. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. ,2007,23 175-205.；金龙国，王川，刘进元.植物MicroRNA.中国生物化学与分子生物学报，2006， 22 =609-614.)。植物miRNA主要通过切割靶基因mRNA，或抑制靶mRNA翻译，来调控植物个 体生长发育并影响其生理过程，是一种新的基因调控模式，具有重要的研究意义(Voirmet 0. Origin, biogenesis, andactivity of plant microRNAs· Cell，2009，136 :669_687·)。水稻不仅是世界最重要的粮食作物之一，同时也是一种重要的模式生物，在植物 研究特别是单子叶植物研究中占有重要地位。目前已经发现了相当数目的水稻miRNA基 因，但发现的水稻miRNA基因数量还只是生物体内全部miRNA基因数的一部分，可能仍存 在着相当大一部分未被发现的miRNA，它们一般在结构或者序列上非保守，表达具有低丰 度、组织特异性或者诱导特异性的特点。这也提示我们在水稻某个特定生长时期、某些特定 组织、某种特殊胁迫处理条件下，通过最新的技术手段，仍然有望发现该条件特异表达的新 miRNA。而尽可能多地发现水稻中的miRNA，对于全面了解水稻乃至整个植物miRNA的形成 过程、结构特点和功能机制具有现实意义。我国是世界上人口最多的国家，同时也是主要的稻米生产和消费国，水稻对于我 国具有举足轻重的地位。国内外除了利用常规育种手段之外，逐步运用基因工程技术对水 稻品质(产量、抗虫、抗旱等)进行遗传改良已经成为了一种趋势。由于miRNA对植物有广 泛的调控作用，很可能成为植物遗传改良的重点研究基因之一，因此迫切需要通过大规模 测序方法充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的miRNA基因，从而为后期定向改良和培 育优质性状的水稻品种奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供来源于水稻的miRNA-n3及其应用。本发明保护的miRNA-n3的序列如下(5’ 一 3’)CUUCGGGGGAGGAGAGAAGC (序列表的序列 1)。本发明保护的miRNA-n3前体(pre-miRNA_n3)序列如下(5’ 一 3，)GGUUUUCUUGGAUCUCUCUCUCCCUUGAAGGCUAUCUCAUGGAG⑶UUGAUGUACACCAUU⑶UGCCUA AGAAACUGAGAAAGCCUUCGGGGGAGGAGAGAAGCCAAGCAAGCC。(序列表的序列 2)。本发明还保护序列1所示RNA在抑制bHLH转录因子基因(0s02g0178700)表达中的应用；所述bHLH转录因子如序列表的序列3所示。所述bHLH转录因子基因可如序列表 的序列4自5’末端第79至711位核苷酸所示。所述bHLH转录因子基因也可如序列表的 序列4所示。本发明还保护序列1所示RNA在促进bHLH转录因子基因(0s02g0178700) WmRNA 降解中的应用；所述bHLH转录因子如序列表的序列3所示。所述bHLH转录因子基因可如 序列表的序列4自5’末端第79至711位核苷酸所示。所述bHLH转录因子基因也可如序 列表的序列4所示。序列表的序列1所示的RNA和/或序列表的序列2所示的RNA可用于水稻种质改
良οSolexa克服了常规miRNA克隆技术的缺点，具有灵敏度高的优点，能够检测出最 少一个小RNA分子，并且准确性高，检出的小RNA分子碱基错误率极低。同时该技术还具有 高通量、大规模的特点，能够覆盖整个基因组，两个文库的测序量高达500万条小RNA序列 以上。基于这种最新的测序手段，将有望识别水稻中过去难以发现的低丰度或者某些条件 下特异表达的新miRNA。本发明采用国际上先进的Solexa高通量测序技术结合生物信息学分析、 Northern杂交、5’ RACE等多种生物学手段，首次从基因组水平鉴定到miRNA-n3，并且证实 miRn3的靶基因为bHLH转录因子基因，参与了植物发育过程的调控。过表达miRNA-n3的转 基因植株会有明显的发育方面的变化(根毛的长度、开花的时间等)，这都将为水稻的品质 育种(如培育抗逆性水稻)提供宝贵的基因资源，带来一定的研究价值和社会效益，并最终 用于实际生产。本发明提供的miRNA广泛参与了水稻多种生命活动的调节，具有重要的生 物学意义和潜在应用价值。
图1为小RNA测序数据中分离和鉴定新miRNA的流程图。图2为0Sa-miRn3的前体二级结构图；黑线部分指示成熟miRNA所在的位置。图3为Northern杂交检测不同浓度H2O2处理的水稻幼苗中osa_miRn3的表达。图4为0Sa-miRn3的靶基因5’ RACE验证；序列上方的箭头表示发生切割的位点， 数值表示该切点处发生切割的克隆数与克隆总数比值。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中所用水稻品种均为籼稻品种93-11 (Oryza sativa L. ssp indica cv. 93-11)，水稻种子购自国家农作物种质保存中心(中国农业科学院作物科学研究所，邮 编100081联系电话010-68919715)。该水稻品种已经由中国北京基因组研究所完成基因 组测序工作。 实施例1、miRNA_n3的发现
一、H2O2 处理
水稻种子经表面消毒后，37°C浸泡24h，然后催芽萌发45h。萌发后将水稻转移 到光照培养箱中，培养箱条件设定为温度28°C /21 V (白天16h/夜晚8h)，光照强度 400μ mol/m2 · s，相对湿度70%，由Hogland营养液提供水稻生长所需的全部营养，营养液 每2天更换一次。12天龄的水稻幼苗采用H2O2处理分别浸泡在0. 6mM、3. OmM和15. OmM H2O2水溶 液中，将浸泡在蒸馏水中的水稻幼苗作为对照；各种处理的幼苗同时置于25°C摇床中处理 6h。处理完毕后，将各个处理的水稻样品按0. 5g分装，液氮速冻后保存于-80°C备用。二、miRNA_n3 的发现1、RNA 提取将水稻样品在液氮中研磨，用TRIZOL试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，操作步骤 按TRIZOL试剂盒自带的说明书进行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度计(Amersham Biosciences)测定提取的RNA在260nm(OD26tl)和280nm(OD28tl)波长的吸光度值以确定RNA 的纯度和浓度。质量合格的RNA浓度应在1 μ g/ μ 1以上，OD260/OD280的比值在1. 8-2. 0之 间，且经电泳检测条带清晰，无明显降解和DNA污染。2、小RNA文库的构建将质量检验合格的水稻幼苗总RNA用于构建小RNA文库。3种浓度(0. 6mM、3. OmM 和15. OmDH2O2处理的水稻样品提取的RNA各取10 μ g等量混合，总共30 μ g用于构建水 稻幼苗H2O2处理的小RNA文库。对照样品提取的RNA取30 μ g，用于构建水稻幼苗对照小 RNA文库。小RNA文库的构建按照Illumina Sample Preparation Protocol文库构建方 法进行，构建好的文库采用Solexa高通量测序(北京华大基因研究中心)，获得高质量的 18-30nt的小RNA序列(两个小RNA文库均获得了五百多万条序列)。3、两个小RNA文库中应答H2O2的miRNA的鉴定参考之前国外文献对高通量测序数据分析的成功方法(Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification of plant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell，2004，14 :787_799.)，建立一套计算机分 析方法用来发现和鉴定测序数据中的水稻miRNA(分析流程如图1所示)。①将获得的两个 小RNA文库中的原始序列通过计算机方法去掉3’接头，并过滤掉序列长度在ISnt以下的序 列，获得所谓的“干净”序列库；②通过SOAP程序(Li R，Li Y,Kristiansen K,Wang J. SOAP short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics, 2008, 24713-714.)将 “干净”序列库中的序列与水稻93-11基因组(http://rice. genomics, org. cn/rice/)进 行匹配，保留能与基因组完全匹配的序列，进行后续分析；③将与基因组匹配的序列与国 际权威的 miRNA 数据库 miRBase (http//microrna. Sanger, ac. uk/sequences/)中公布的 水稻miRNA成熟序列及前体序列进行BLAST，从而发现哪些序列来自于已知的水稻miRNA， 不能与已知miRNA匹配的序列再进入下一步分析；④将剩下的基因组匹配序列再与其它 非编码 RNA 数据库(ftp://ftp. sanger. ac. uk/pub/databases/Rfam/)、重复序列数据库 (ftp://ftp. tigr. org/pub/data/TIGR_Plant_Repeats/)以及 93-11 蛋白编码基因数据 库(http://rice, genomics, org. cn/rice/)进行匹配，从而发现哪些序列来自于其它非编 码RNA、重复序列以及蛋白编码基因，过滤掉这些序列，剩下的序列中可能含有新的miRNA， 称为潜在miRNA序列库；⑤将潜在miRNA序列库中的序列还原到基因组中，取基因组中该序列上下游各150nt进行二级结构分析，若能形成类似miRNA前体(pre-miRNA)的良好茎 环结构且其该序列在茎环结构中位置符合成熟miRNA要求，则该序列可以认为是候选的新 miRNA ；⑥考察候选的新miRNA序列所在的茎环结构前体的小RNA分布特征，若主要分布在 候选的新miRNA区域以及对应的miRNA*区域，则认为该候选的新miRNA序列高度可信，是 真实的 miRNA 序列(Meyers B C, Axtell M J,Bartel B,Bartel D P,Baulcombe D,Bowman J L,Cao X,Carington J C,Chen Χ,Green P J,et al. Criteria for annotation of plant microRNAs. Plant Cell,2008，20 :3186_3190.)。鉴定到1 个新的 miRNA，命名为 osa_miRn3 (miRn3 ；miRNA-n3)。osa-miRn3 的序列如下(5，— 3，)CUUCGGGGGAGGAGAGAAGC。H2O2处理小RNA文库的测序次数(Q_2)为48，对照小RNA文库(Qwm)的测序次数 为47。miRNA前体(pre_miRNA)序列的二级茎环结构是miRNA基因最显著的特点之一，也 是所有miRNA鉴定方法都不可逾越的重要规则。osa-miRn3 前体(pre-osa_miRn3)序列如下(5，一 3，)GGUUUUCUUGGAUCUCUCUCUCCCUUGAAGGCUAUCUCAUGGAG⑶UUGAUGUACACCAUU⑶UGCCUA AGAAACUGAGAAAGCCUUCGGGGGAGGAGAGAAGCCAAGCAAGCC(序列表的序列 2)。pre-osa-miRn3能形成良好的茎环结构，成熟的miRNA从miRNA前体的茎部产生， 完全符合miRNA前体的结构特征(见图2)。三、miRNA Northern 杂交为了进一步验证osa-miRn3具有应答H2O2的表达模式，采用miRNA Northern杂交 检测几种H2O2处理浓度下(0、0. 6,3. O、15. OmM)miRNA的表达情况。1、制备探针检测osa-miRn3 的探针(5，一 3，)的序列GCTTCTCTCCTCCCCCGAAG。采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)对上述序列末端磷酸基团进行 同位素(Y -32P ATP)标记，得到探针，用Microspin G-25柱(GE Healthcare)纯化探针，去 除未标记的同位素，纯化后的探针用于Northern杂交。2、miRNA Northern 杂交Northern杂交中，每个泳道上样量为20 μ g低分子量RNA，TO基因作为内参，与 miRNA在同一张膜上检测。TO基因的探针序列为TATGCGTGTCATCCTTGCGCAG。(1)分别提取步骤一制备的各水稻样品的总RNA。(2)采用 Park 等报道的 PEG8000/NaCl 沉淀法(Park W, Li J, Song R, MessingJ， Chen X. CARPEL FACTORY,a Dicer homolog, and HENl, a novel protein,act inmicroRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol.，2002，12 :1484_1495.)从总 RNA 中富 集低分子量RNA (有利于提高miRNA的检测能力)。(3) miRNA Northern 杂交①富集的低分子量RNA溶于DEPC水，再加入等体积的2 X RNA上样缓冲液(95%甲 酰胺，18mM EDTA, 0. 1 %溴酚蓝和0. 1 %二甲苯青)，混合后95°C变性5min，得到RNA样品。②RNA样品用15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后用电转移装置 (BIO-RAD)转移到 Hybond N+尼龙膜(Amersham Biosciences)上。
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③转移有RNA样品的尼龙膜经6XSSC溶液短暂漂洗，紫外交联 (Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h，使RNA完全固定在尼龙膜上。④将转移了 RNA的尼龙膜放入杂交管中，加入5ml ULTRAhyb-Oligo杂交液 (Ambion)在杂交炉中42°C预杂交2h，然后加入探针，混勻，42°C杂交过夜。⑤杂交结束后，小心倒出杂交液，加入含0. 5% SDS的2XSSC溶液，42°C洗涤三次， 每次IOmin。⑥洗膜结束后，将膜用保鲜膜包裹，平整压于X光片下，附加增感屏，-70°C曝光1 周。⑦曝光结束后，冲洗X光片，进行光密度扫描，以对照组的杂交信号为1，计算各个 处理组杂交信号的相对强度。结果见图3。Northern杂交结果和测序数据很吻合，osa-miRn3几乎不受H2O2诱 导表达，暗示了它在氧化胁迫中可能起不同的作用。实施例2、miRNA的靶基因预测与验证由于植物miRNA与靶基因mRNA近乎完全互补，因此可以通过生物信息学方法预测 osa-MIRn3的靶基因。采用Schwab等描述的方法预测miRNA的靶基因(Schwab R，Palatnik J F,Riester Μ,Schommer C,Schmid Μ,Weigel D. Specific effects ofmicroRNAs on the plant transcriptome. Dev. Cell, 2005,8 :517_527.)。使用 Patscan程序在水稻 93-11 全长 cDNA和基因库(http://rice. genomics, org. cn/rice/)中寻找能与miRNA序列近乎完全互 补的cDNA或基因，即为miRNA的靶标；参数设置为=Patscan程序参数为默认设置，允许最 大错配数为3个，miRNA的第10和11位碱基不允许有错配，靶标的功能通过NCBI (http // www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性检索，以同源性最高的已知功能基因进行注释。预测结果见表1。表losa-MIRn3的靶基因及功能 osa-miRn3 的靴基因为 bHLH 转录因子(bHLH transcription factor)基因 0s02g0178700 (GENBANK ACCESSION NO. 0s02g0178700 ；见序列表的序列 4，其编码的蛋白质 见序列表的序列3)。该类转录因子在植物发育过程中起重要的调控作用，如控制根毛的发 育，调控水稻的分枝发育等。实施例3、miRNA对靶基因mRNA的切割osa-miRn3对靶基因0s02g0178700 (见序列表的序列4)mRNA的切割用5，RACE方 法进行验证(Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification ofplant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell,2004,14 787-799.)。靶基因mRNA被miRNA切割后，其较为稳定的3’切割产物5’端核苷酸磷酸集团暴露，用T4RNA连接酶在该切割产物5’端连接上5’ RACE专用接头；通过反转录反应合 成cDNA ；通过靶基因特异的巢式外引物和试剂盒所带的巢式外引物进行第一轮PCR，靶基 因特异的巢式内引物和试剂盒所带的巢式内引物进行第二轮PCR;将5’RACE获得的PCR产 物连接到PMD 19-T载体后测序，就能知道精确的靶基因mRNA切割位点。1、分别提取实施例1的步骤一制备的各水稻样品的总RNA。2、按Firstchoice RLM-RACE试剂盒(Ambion)操作说明进行5，RACE，靶基因特异 的巢式外弓I物的序列为TGCATGGAAATGTAGTTCTCGGCA，靶基因特异的巢式内引物的序列为 GGACTTGATGGCACGCTTCCTCTC。3、PCR产物进行琼脂糖电泳，回收170bp左右的特异条带(图4中泳道1所示)。4、将回收的PCR产物连接到pMD 19-T载体(TaKaRa)，并转化大肠杆菌 DH5α (TaKaRa)。5、挑单克隆测序，根据测序结果确定靶基因mRNA的切割位点。PCR产物的电泳图和测序结果显示的切割位点见图4。osa-miRn3的靶基因在与其 互补的区域发生了切割，这个结果强有力的证明了 0s02g0178700确实是0Sa-miRn3体内真 正调控的靶基因(图4中，有两个切割位点，切割概率比为1 8)。
权利要求
序列表的序列1所示的RNA。
2.序列1所示RNA在抑制bHLH转录因子基因表达中的应用；所述bHLH转录因子如序 列表的序列3所示。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述bHLH转录因子基因如序列表的序列4 自5’末端第79至711位核苷酸所示。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述bHLH转录因子基因如序列表的序列4 所示。
5.序列1所示RNA在促进bHLH转录因子基因的mRNA降解中的应用；所述bHLH转录 因子如序列表的序列3所示。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述bHLH转录因子基因如序列表的序列4 自5’末端第79至711位核苷酸所示。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述bHLH转录因子基因如序列表的序列4 所示。
8.序列表的序列2所示的RNA。
9.序列表的序列1所示的RNA和/或序列表的序列2所示的RNA在水稻种质改良中的应用。
全文摘要
本发明公开了来源于水稻的miRNA-n3及其应用。本发明保护的miRNA-n3是序列表的序列1所示的RNA。本发明保护的miRNA-n3前体(pre-miRNA-n3)是序列表的序列2所示的RNA。本发明还保护序列1所示RNA在抑制bHLH转录因子基因表达和/或促进bHLH转录因子基因的mRNA降解中的应用。所述bHLH转录因子如序列表的序列3所示。应用miRNA-n3有望获得在生长发育以及耐受逆境胁迫方面有重要表型的植株，具有重要的生物学意义和潜在应用价值，将为水稻的良种培育(如培育抗逆性水稻)提供宝贵的基因资源，具有重要的研究价值和潜在的社会效益，并最终用于生产实践。
文档编号A01H5/00GK101892232SQ201010221438
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者刘进元, 李甜 申请人:清华大学