专利名称：：检测环境化学物的雄性生殖毒性的制剂及模型建立方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种用于检测环境化学物的雄性生殖毒性的制剂和模型建立方法。
背景技术：
：随着经济社会，特别是现代工业的快速发展，人类接触外源化学物如医药、农药、食品添加剂以及环境中存在的各种污染物日益增多，其中许多物质反复接触后可损伤生殖细胞，引起生殖毒性。在雄性，具体表现为睾丸各级生精细胞受损，继而导致精液质量下降、精子DNA损伤等，由于精子DNA损伤不仅是引起不育的重要原因，也是辅助生育治疗成功率下降的重要因素，而且，携有DNA损伤的幸存精子可能逃避体内精子选择机制而将遗传缺陷传递给子代，从而显著增加先天性缺陷甚至儿童期肿瘤的发生风险，因此研发一种检测方法和手段，能够快速、准确评估化学物的雄性生殖毒性、特别是对精子DNA的潜在危害，已经成为环境学、医学、药理和毒理学领域迫切需要解决的问题，同时也可为优生优育的提供保证。根据目前国际上检测外源化学物的雄性生殖毒性的方法，我国2006年11月颁布的《药物生殖毒性研究技术指导原则》中指出雄性生殖毒性的检测主要包括以下策略(1)雄性动物(大、小鼠或家兔)交配前染毒或给药4-10周，交配成功后处死，观察睾丸组织病理结构，主要观察终点为生殖器官的退变或坏死、精子计数、精子活力或形态学检测、交配行为、内分泌功能或总体生育力改变；(2)染毒交配后，观察胎仔数目和质量，评价父代染毒对子代发育的影响。然而，以上策略耗时很长(一月到数月)且观察终点比较粗略，不能反映精子遗传物质的隐性损伤。如果能够有一种替代方法，可以实现既灵敏又快速的反映化学物造成的雄性生殖危害，将有助于我们更准确的评价化学物的安全性，也有利于缩短药品的临床前生殖毒性实验周期。
发明内容发明目的本发明针对上述技术空白，提供一种用于检测环境化学物的雄性生殖毒性的制剂和模型建立的方法，该制剂含有特异性的抑制小鼠oggl基因表达的双链siRNA，将其应用于小鼠睾丸微环境敲减基因表达后，能建立快速灵敏检测环境化合物对雄性生殖毒性的模型。技术方案有助于检测环境化合物雄性生殖毒性的制剂，该试剂含有以下三段双链siRNA双链1由SEQIDNo1和SEQIDNo2组成；双链2由SEQIDNo3和SEQIDNo4组成；双链3由SEQIDNo5和SEQIDNo6组成。检测环境化合物雄性生殖毒性的模型建立方法，步骤为选择刚断乳的新生雄性ICR小鼠，2%wt戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，局部酒精消毒，备皮，耻骨联合上区手术，暴露小鼠睾丸；显微注射Wt台盼蓝与上述检测试剂等体积混合稀释，检测试剂的剂量范围30nmol300nmol，显微注射至精曲小管充盈，一侧睾丸注射混合稀释后的检测试剂，另一侧睾丸注射对照，术后缝合获得检测环境化合物雄性生殖毒性的模型。检测试剂使用的剂量优选30nmol。原理各种有害环境化学物作用于精子，会产生损伤效应，包括精子DNA的损伤。而机体的损伤修复机制可以对抗损伤、保护遗传信息稳定性。发明人研究发现，DNA损伤修复基因oggl可保护生殖细胞免受外源化学物所致损伤。利用本发明所保护的双链siRNA制剂特异性敲减oggl基因在小鼠精母细胞的表达，更能灵敏的反映外源化学物的损伤效应(图1)。进而在小鼠睾丸微环境敲减oggl，可增加雄性生殖系统对受试化学物所致损伤的易感性。由此，建立小鼠睾丸微环境基因敲减模型结合染毒方法评价外源化合物的生殖毒性效应，较之离体实验更为真实客观，较之转基因试验和普通染毒试验更为快捷有效，该技术对于一大类具有雄性生殖毒性的环境化学物的检测和安全评估有一定推广意义。有益效果本发明提供的用于检测环境化学物对雄性生殖毒性的试剂和模型建立的方法，可以实现既灵敏又快速的反映化学物造成的雄性生殖危害，将有助于我们更准确的评价化学物的安全性，也有利于缩短药品的临床前生殖毒性实验周期。四图1，实施例1中，小鼠精母细胞oggl-RNA干扰后原位杂交验证敲减效率及外源化学物氰戊菊酯农药(Fen)25uM染毒后彗星实验检测细胞DNA损伤结果。A，C为正常对照，B，D为siRNA双链干扰组。箭头显示oggl典型的核定位表达被敲减。表明，oggl在小鼠精母细胞中有修复DNA损伤、维持遗传稳定的作用；图2，实施例1中，小鼠睾丸微环境敲减oggl模型建立成功。术后2周睾丸冰冻切片原位杂交结果显示oggl敲减成功，且不影响自身的生精过程，适合作为染毒的模型；其中=Oggl敲减A、C，对照序列:B、D，显微注射:A、B，原位杂交C、D。图3，实施例2中，不同浓度白消安处理小鼠4周后，睾丸OgglsiRNA敲减组及对照组的精液参数、精子DNA损伤变化情况的柱状示意图。*与O周(染毒前)比较，P<0.05;#与O周(染毒前)比较，P<0.01。图4，实施例2中，睾丸病理HE染色。相同染毒剂量(白消安5mg/kg)染毒4周，oggl敲减组(图3A，左侧睾丸)和对照组(图3B，右侧睾丸)相比，敲减组可以更灵敏的反映外源化合物的睾丸的损伤效应；图5，实施例2中，睾丸病理透射电镜。相同染毒剂量(白消安5mg/kg)染毒4周，oggl敲减组(图4A，左侧睾丸)和对照组(图4B，右侧睾丸)相比，敲减组可以更灵敏的反映处源化合物的睾丸的损伤效应；图6，实施例3中，小鼠白消安染毒(5mg/kg)0、2、4周时间，oggl敲减组及对照组精液参数、精子DNA损伤变化情况的柱状示意图。*与O周(染毒前)比较，？<0.05;#与O周(染毒前)比较，P<0.01。图7，实施例4中，小鼠睾丸微环境oggl基因敲减模型经受试农药染毒2周后精子DNA损伤情况的柱状示意图。*与溶剂对照组比较，P<0.05；#与溶剂对照比较，P<0.01。图8，实施例4中，小鼠睾丸oggl敲减模型，白消安lmg/kg(A)，受试农药5mg/kg(B)，受试农药10mg/kg(C)，受试农药20mg/kg(D)，染毒2周。结果显示睾丸oggl敲减的动物模型可以快速、灵敏的反映外源化学物致小鼠睾丸损伤的生殖毒性。五具体实施例方式以下结合实例对本发明作进一步的描述实施例1(1)靶向oggl基因的特定双链SiRNA的干扰序列的设计、合成。①设计并合成靶向oggl基因的特定的SiRNA干扰序列。siRNA-oggl序列设计的双链序列如下所示，对照组为无关序列siRNA双链。上述siRNA干扰片段均设计成双链组合并经化学修饰(主要是末端经过TT修饰)，可稳定至少3周不被降解。②靶向oggl的siRNA双链序列(很可能是下列中的全部或者部分)候选双链1(RNA)-UUGGGAAGCCAUGAUAA⑶GACAUC(RNA)-GAU⑶CACUUAUCAUGGCUUCCCAA候选双链2(RNA)-AGCUGAAUGAGUCGAGGUCCAAAGG(RNA)-CCUUUGGACCUCGACUCAUUCAGCU候选双链3:(RNA)-AAACCAAGUCCAGACGCAGCUCAGA(RNA)-UCUGAGCUGCGUCUGGACUUGGUUU③体外细胞试验证实靶向oggl的siRNA双链的敲减效率及生物学功能，显示特异性敲减DNA修复基因oggl在小鼠精母细胞的表达，精母细胞更易受损伤、更能灵敏的反映外源化学物的损伤效应(图1)。(2)建立小鼠睾丸微环境oggl基因敲减模型。①动物选择处理选择刚断乳的新生雄性ICR小鼠(此发育阶段便于观察精子生成第一个高峰)6只/组，2%wt戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，局部酒精消毒，备皮，耻骨联合上区双侧腹股沟处手术，切口0.5cm，暴露小鼠左、右双侧睾丸。②显微注射wt台盼蓝与干扰siRNA双链(剂量范围30nmOl300nmol，优选是30nmol)等体积混合稀释后，显微注射至精曲小管充盈(图2)，左侧睾丸注射oggl干扰组，右侧睾丸注射对照，每组注射2uL。缝合手术区皮肤并注意小鼠保温(麻醉后基础代谢率降低，可能会导致新生鼠死亡)。③证实oggl睾丸敲减的动物模型成功建立小鼠睾丸冰冻切片原位杂交、荧光定量PCR均验证oggl基因敲减2周后仍有效(图2)，oggl表达被下调，同时睾丸组织观察精子数目及睾丸形态、TUNEL试剂盒检测精子DNA完整性。上述结果显示，靶向oggl的siRNA敲减有效，睾丸微环境oggl低表达的动物模型建立，且该操作本身不会引起精子DNA的异常。(3)取上述已建立的动物模型，运用待测试化学物(如药物、化学品、农药等环境毒物)经口染毒2周，评价该化学物生殖毒性，如睾丸形态、精子数目、特别是精子DNA损伤(TUNEL试剂盒检测)等，以验证该动物模型用于生殖毒性评价的灵敏度和快速性。具体内容见下述具体实施案例。实施例2取本发明所涉及的动物模型，不同浓度的阳性药物(白消安lmg/kg，5mg/kg)经口染毒4周。精子计数及精子DNA损伤(TUNEL值)结果显示(表1，图3)在较低浓度剂量浓度染毒时(lmg/kg)，与普通染毒(即右侧对照睾丸)比较，左侧oggl敲减睾丸更易检出DNA损伤效应。睾丸病理HE染色(图4)及透射电镜(图5)的结果也同样显示相同染毒剂量下(白消安lmg/kg)，oggl敲减组(左睾丸)和对照组(右睾丸)相比，敲减组可以更灵敏的反映外源化合物的睾丸损伤效应。表1不同浓度白消安处理小鼠4周后，ogglSiRNA干扰组及正常对照组的精液参数及精子DNA损伤变化表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*与溶剂对照组比较，P<0.05；#与溶剂对照组比较，P<0.01实施例3取本发明所涉及的动物模型(左侧睾丸oggl敲减，右侧睾丸对照序列)，同浓度的白消安(5mg/kg)经口染毒，分别于0、2、4周时观察生殖毒性效应(主要为精子数目、DNA损伤)。结果显示较之传统方法，oggl敲减组在更短时间内，即可检测出DNA损伤效应，(表2，图6)。表2小鼠白消安染毒(5mg/kg)不同时间段，干扰组及对照组的精子数及DNA损伤的变化表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*与O周(染毒前)比较，P<0.05与O周(染毒前)比较，P<0.01实施例4取本发明所涉及的动物模型，分组溶剂对照组(阴性组)/阳性组(白消安)/受试物(某种拟除虫菊酯类农药，其主要成分是氰戊菊酯和眯菊酯)经口染毒。具体方案选择上述oggl敲减小鼠25只，每组5只，受试农药设3个剂量组(分别是5mg/kg，10mg/kg,20mg/kg)。siRNA片段显微注射(左侧睾丸干扰组，右侧睾丸对照组)。次日开始各组别染毒，灌胃每天一次，持续2周。处死小鼠，取睾丸组织，综合评价各项效应指标，主要关注精子DNA损伤效应及睾丸病理变化(表3，图7、图8)。结果提示oggl敲减的动物模型可以快速、灵敏的检测出外源化学物致小鼠精子DNA损伤的生殖毒性。表3小鼠睾丸微环境oggl基因敲减模型小鼠受试物染毒2周后精子DNA损伤情况表。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*与溶剂对照组比较，P<0.05；#与溶剂对照比较，P<0.0权利要求检测环境化学物的雄性生殖毒性的制剂，其特征在于该试剂含有以下三段双链siRNA双链1由SEQIDNo1和SEQIDNo2组成；双链2由SEQIDNo3和SEQIDNo4组成；双链3由SEQIDNo5和SEQIDNo6组成。2.检测环境化合物雄性生殖毒性的模型建立方法，其特征在于步骤为a.选择刚断乳的新生雄性ICR小鼠，2%wt戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，局部酒精消毒，备皮，耻骨联合上区手术，暴露小鼠睾丸；b.显微注射wt台盼蓝与上述检测试剂等体积混合稀释，检测试剂的剂量范围30nmol300nmol，显微注射至精曲小管充盈，一侧睾丸注射混合稀释后的检测试剂，另一侧睾丸注射对照，术后缝合获得检测环境化合物雄性生殖毒性的模型。3.根据权利要求2所述的检测环境化合物雄性生殖毒性的模型建立方法，其特征在于检测试剂使用的剂量为30nmol。全文摘要本发明涉及一种双链siRNA及其应用，特别是涉及一种DNA损伤修复ogg1基因的双链siRNA，将其应用于小鼠睾丸微环境敲减基因表达，可提高雄性生殖系统对环境化学物的损伤作用的敏感性，从而提供一种快速、灵敏的检测环境化学物的雄性生殖毒性的方法。本发明作为环境化学物生殖毒性的检测的新方法，可以实现既灵敏又快速的反映化学物造成的雄性生殖危害，将有助于我们更准确的评价化学物的安全性，也有利于缩短药品的临床前生殖毒性实验周期。文档编号A01K67/027GK101805751SQ201010129228公开日2010年8月18日申请日期2010年3月19日优先权日2010年3月19日发明者吉贵祥,王心如,赵鹏,顾爱华,龙燕申请人:南京医科大学