专利名称：一种蛹虫草菌种选育方法
技术领域：
本发明涉及一种蛹虫草菌种选育方法。
背景技术：
现有的蛹虫草菌种选育时，获取孢子后， 一般通过平板划线和涂布的方法，以将孢子稀 释到合适的程度，待菌落形成后，作进一步的挑选。这种选育方法虽然操作简单，但是由于 技术本身的限制，难以获得单孢生长形成的菌落，获得的菌落需要进行进一步的分离和挑选 。这一方法需要进行大量的重复性劳动，分离效率低，选育耗时长，难以满足生产的需要。
也有部分采用梯度稀释法将孢子到一定程度，然后在培养基中涂布培养以获得单孢生长 形成的菌落。这一方法能够获得纯种菌种，但是因为单孢的数量巨大，生长形成的菌落同样 也是很多的，仍需要进行大量的筛选工作，挑选部分发到性状优良的菌落进行后续的培养， 总的工作量也没有减少多少，效率依然不高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种简单高效获取具有优良性状纯种蛹虫草单孢的方法
技术领域：
本发明采取的技术方案是 一种蛹虫草菌种选育方法，包括以下步骤
1) 从蛹虫草菌苔表面刮取孢子，加入到装有无菌水的容器中，充分振荡摇匀，稀释至 所需倍数，制得蛹虫草孢子悬浮液；
2) 配制缺乏营养的基本培养基，高温灭菌后，保温使其处于液态；
3) 配制营养丰富的加富培养基，高温灭菌后，保温使其处于液态，备用；
4) 在培养皿中倒入基本培养基，在培养基还处于液态时，吸取蛹虫草孢子悬浮液加入 培养皿中，摇动培养皿使孢子悬浮液和基本培养基混合均匀；待培养皿中基本培养基凝固后 ，再倒入一层基本培养基，第二次倒入的培养基凝固后，在培养皿中倒入一层加富培养基。
5) 培养皿中的加富培养基凝固后，将培养皿置于20 25。C恒温培养箱中倒置培养。
6) 观察培养过程中各菌落的生长情况，选取生成快，扩张快，菌丝浓密的菌落进行后 续试验。
本发明的有益效果是基本培养基上营养有限，性状优良、活力高的蛹虫草孢子能够较快的萌发，利用其中有限的营养进行菌丝生长；性状差、活性低的孢子萌发后，由于缺乏营 养，难以继续生长。性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快，能够较早的进入下一个基本 培养基层，抢先利用其中有限有营养，进而抑制其他蛹虫草孢子产生的菌丝的生长。性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快，能够较早的进入加富培养基 层，优先利用加富培养基的丰富营养，快速生长形成菌落；性状较次、活力较低的蛹虫草孢 子，其菌丝生长到加富培养基所用的时间更长，此时培养基中的营养已大量被其他性状更为 优良的蛹虫草菌丝利用，难以形成可观的菌落。这样培养时，通过培养基的层层筛选，大量性状差、活力低的蛹虫草孢子被淘汰掉，剩 下的为性状优良、活力高的蛹虫草纯种，大大减少了筛选的工作量，便于后续实验中挑选性 状优良的菌落，有效提高了筛选效率。
具体实施方式
下面结合实例，进一步说明本发明。 一种蛹虫草菌种选育方法，包含以下步骤1) 从蛹虫草菌苔表面刮取孢子，加入到装含有无菌水和蛹虫草孢子分散剂吐温-80的三 角瓶中，三角瓶中加入玻璃珠，使用回旋振荡器充分振荡摇匀，然后稀释至所需倍数，制得 蛹虫草孢子悬浮液；2) 配制缺乏营养的基本培养基PDA基本培养基，其配方为水600-800ml 马铃薯80-100g 葡萄糖15-18g 琼脂15-18g高温灭菌后，45 高温灭菌后，45'C保温使其处于液态，临用前每l升培养基中加入无菌的12-16ml浓度为2呢去 氧胆酸钠溶液和l. 8-2ml浓度为10000-15000u/ml的链霉素溶液，混合均匀，制得PDA基本选 择培养基；3) 配制营养丰富的加富培养基加富PDA培养基，其配方为水600-800ml马铃薯80-100g葡萄糖15-18g 琼脂15-18g磷酸氢二钾1.5-1.8g硫酸镁0. 7-0.9g蛋白胨2-2. 5g 蚕蛹粉2-2. 5g，高温灭菌后，保温使其处于液态，备用；4) 在培养皿中倒入PDA基本选择培养基，当培养基还处于液态时，吸取蛹虫草孢子悬浮液加入培养皿中，摇动培养皿使孢子悬浮液和PDA基本选择培养基混合均匀；待培养皿中PDA基本选择培养基凝固后，再倒入一层PDA基本选择培养基，第二次倒入的培养基凝固后， 在培养皿中倒入一层加富PDA培养基；三层培养基的厚度基本相同，均为l 2mm;5) 培养皿中的加富PDA培养基凝固后，将培养皿置于20 25。C恒温培养箱中倒置培养；6) 观察培养过程中各菌落的生长情况，选取生成快，扩张快，菌丝浓密的菌落进行后 续试验。使用分散剂之后，孢子分散更均匀，且不易沉降，保证了孢子悬浮液的均匀性，有利于 实验的进行；加入玻璃珠，更容易将刮取的孢子打散，使用回旋振荡器振荡，振荡均匀迅速 ，有效提高实验效率。除了吐温-80，也可以使用其他对孢子无毒害作用的分散剂，如维生 素E、吐温-60等。培养基优选的保温温度为45 6(TC，既便于操作，也不会因为过热对孢子造成不良影响PDA基本培养基也可以使用其他培养基代替，只要能保证蛹虫草孢子萌发后有基本的生 长营养即可，本领域的技术人员可以很容易根据实际情况选择不同的配方。加富PDA培养基也可以使用其他培养基代替，只要营养丰富、适宜蛹虫草菌丝生长即可 ，本领域的技术人员可以很容易根据实际情况选择不同的配方。除了去氧胆酸钠、链霉素，微生物抑制剂也可以是一般的活性抗生素，如四环素、氯霉 素、青霉素，但不能使用对蛹虫草孢子抑制作用太强化学杀菌剂，如人工合成的酰基化抗生 素。基本培养基上营养有限，性状优良、活力高的蛹虫草孢子能够较快的萌发，利用其中有 限的营养进行菌丝生长；性状差、活性低的孢子萌发后，由于缺乏营养，难以继续生长；培 养基中加入了微生物抑制剂，能够抑制培养基中细菌的霉菌的生长，避免杂菌感染，影响试 验结果；同时微生物抑制剂对蛹虫草孢子的萌发也有一定的抑制作用，这样活力低、性状差 的孢子就难以萌发。性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快，能够较早的进入下一个基本 培养基层，抢先利用其中有限有营养，进而抑制其他蛹虫草孢子产生的菌丝的生长。性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快，能够较早的进入加富培养基 层，优先利用加富培养基的丰富营养，快速生长形成菌落；性状较次、活力较低的蛹虫草孢 子，其菌丝生长到加富培养基所用的时间更长，此时培养基中的营养已大量被其他性状更为 优良的蛹虫草菌丝利用，难以形成可观的菌落。这样培养时，通过培养基的层层筛选，大量性状差、活力低的蛹虫草孢子被淘汰掉，剩 下的为性状优良、活力高的蛹虫草纯种，大大减少了筛选的工作量，便于后续实验中挑选性 状优良的菌落，有效提高了筛选效率。
权利要求
1.一种蛹虫草菌种选育方法，其特征在于包含以下步骤1)从蛹虫草菌苔表面刮取孢子，加入到装有无菌水的容器中，充分振荡摇匀，稀释至所需倍数，制得蛹虫草孢子悬浮液；2)配制缺乏营养的基本培养基，高温灭菌后，保温使其处于液态；3)配制营养丰富的加富培养基，高温灭菌后，保温使其处于液态，备用；4)在培养皿中倒入基本培养基，当培养基还处于液态时，吸取蛹虫草孢子悬浮液加入培养皿中，摇动培养皿使孢子悬浮液和基本培养基混合均匀；待培养皿中基本培养基凝固后，再倒入一层基本培养基，第二次倒入的基本培养基凝固后，在培养皿中倒入一层加富培养基。5)培养皿中的加富培养基凝固后，将培养皿置于20～25℃恒温培养箱中倒置培养。6)观察培养过程中各菌落的生长情况，选取生成快，扩张快，菌丝浓密的菌落进行后续试验。
2.根据权利要求l所述的一种蛹虫草菌种选育方法，其特征在于所述缺乏营养的基本培 养基包括PDA基本培养基，PDA基本培养基的配方为水600-800ml 马铃薯80-100g 葡萄糖15-18g 琼脂15-18g。
3.根据权利要求l所述的一种蛹虫草菌种选育方法，其特征在于所述营养丰富的加富培 养基包括加富PDA培养基，加富PDA培养基的配方为水600-800ml 马铃薯80-100g 葡萄糖15-18g 琼脂15-18g 磷酸氢二钾1.5-1.8g 硫酸镁0. 7-0.9g蛋白胨2-2. 5g蚕蛹粉2-2. 5g。
4.根据权利要求l所述的一种蛹虫草菌种选育方法，其特征在于步骤l)中加入蛹虫草 孢子分散剂。
5. 根据权利要求4所述的一种蛹虫草菌种选育方法，其特征在于所述分散剂包括吐温 -80、维生素E，吐温-60。
6 .根据权利要求l所述的一种蛹虫草菌种选育方法，其特征在于步骤l)中容器中加入 玻璃珠，使用回旋振荡器振荡均匀。
7. 根据权利要求l所述的一种蛹虫草菌种选育方法，其特征在于步骤2)中保温处于液态的基本培养基，临用前加入一种或多种无菌的微生物抑制剂，混合均匀，制得基本选择培养基。
8. 根据权利要求7所述的一种蛹虫草菌种选育方法，其特征在于选用的微生物抑制剂包括去氧胆酸钠、链霉素、四环素、氯霉素、青霉素。
9. 根据权利要求l所述的一种蛹虫草菌种选育方法，其特征在于所述培养基的保温温度 为45 60。C。
全文摘要
本发明公开了一种蛹虫草菌种选育方法。本发明中，将蛹虫草孢子悬浮液与缺乏营养的基本培养基混合均匀，待其凝固后，再倒上一层基本培养基，第二层培养基也凝固了，在其上再倒上一层营养丰富的培养基，然后倒置培养，在培养过程中挑选性状优良的蛹虫草单孢菌落。本发明从培养开始，就通过培养基的层层筛选，将大量性状差、活力低的蛹虫草孢子淘汰掉，剩下性状优良、活力高的蛹虫草纯种，大大减少了筛选的工作量，便于后续实验中挑选性状优良的菌落，有效提高了筛选效率。
文档编号A01G1/04GK101627701SQ20091030566
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者吕尚廉, 郑杰辉, 坤 项 申请人:郑杰辉;项 坤