专利名称：植物根系原位动态观察和测定方法
技术领域：
本发明属于根系生物学、植物营养学、作物栽培学和植物生理学领域，具体涉及一种植物根系原位动态观察和测定方法。
背景技术：
根系是植物吸收养分和水分的主要器官，植物根构型是指根系在
生长介质中的空间分布(Lynch, 1995)。不同根构型能显著影响养分水分的吸收利用(Fitter, 1987; Bowman et al, 1998; Doussan et al， 1998;Liao et al, 2001; Lambers et al， 2006; Skaggs and Shouse， 2008)、碳源分配(Nielsen et al， 1994; Bidel et al, 2000; Coll et al, 2008)以及适应环境胁迫的能力(Miller, 1986; Al-Ghazi et al， 2003)等重要生理功能。因此，研究植物根系三维构型对植物养分水分吸收、品种筛选等具有十分重要的意义。所以近年来植物根系三维构型研究越来越受人们重视，已从表型、生理和分子等不同水平全面开展研究。但是目前国内外对植物根系三维构型的定量化研究的报道极少，根系三维构型定量化研究的主要困难是因为根系在土壤等生长介质中的隐蔽性造成了观察根构型的困难，以及根系本身构型的复杂性和重叠性造成测量精度的限制(马新明等，2003; Zhuetal, 2006)。迄今己有报导中的根系三维构型数据大多是破坏性采样获得的数据，并非原位数据。而且大多根构型与养分效率的研究属于定性研究，对于根构型与养分效率的定量研究还鲜见报道。此外，目前已有的研究大部分都是某一时刻的 构型数据与养分效率的研究，动态的原位根构型数据与养分效率的研究则
未见技术报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有根系形态构型观察和测定方法的局限性，提供一种植物根系原位动态观察和测定方法，在不破坏植物根系三维构型及其周围生长环境的前提下，直接将植物根系原位生长状况进行三维可视化，并结合计算机图像分析，从而对根系的形态和构型进行原位观察和测定。
本发明目的通过以下技术方案予以实现-
提供一种植物根系原位动态观察和测定方法，包括以下步骤
(1) 设计透明的栽培容器和生长介质；
(2) 将种子灭菌和催芽，出芽后移苗到步骤(1)所述透明的栽培容器，保持植物根系在所述透明的生长介质中自然生长；
(3) 采用三维激光扫描仪对根系进行扫描，进行根系三维构型的原位观察和图像捕获，完成图像采集、重建和模拟。
上述步骤(1)所述透明的栽培容器优选透明的圆柱形容器，容器设置有一个可打开的盖子，盖子中间设置一个贯穿洞。根据不同的植物容器大小有所不同，本发明优选采用高20cm、直径12cm的圆柱形有机玻璃容器，贯穿洞优选直径为20mm的圆洞。
上述步骤(1)所述的透明的生长介质为透明培养基。透明培养基是采用与植物适应的相应营养液+0.15°/^tPhytagelTM。
所述透明培养基配置步骤如下(A) 将培养基搅拌均匀，并调节pH值；有机玻璃容器采用紫外线灭菌1小时，备用；
(B) 使用高压灭菌锅将培养基培养基在12rC灭菌30分钟；
灭菌结束尽快(保证培养基未开始凝固)将培养基倒入上述已灭菌的有机玻璃容器内，以上操作在超净工作台进行。
(C) 静置冷却待培养基凝固，大概需要4小时左右；
其中，在培养基快凝固时，不能挪动容器，以防止培养基凝固后里面产生气泡。
对于分层磷处理培养基，需等下层培养基完全凝固后再倒上层培养基，并确保上层培养基倒入时的温度不能太高，但也不能太低以至
于发生凝固，本发明优选设定上层培养基倒入时温度为5(TC左右，，
以保证下层培养基不会没有融化，上层培养基不会很快发生凝固。
上述步骤(3)扫描的方法是从移苗后第1天到第20天每24小时利用三维激光扫描仪扫描植株根系一次，扫描范围为0° 360Q，旋转方向的扫描精度为0.18°,上下移动方向的扫描精度为O.lmm。
实现植物根系三维构型原位动态重建及模拟方法的系统包括三维激光扫描仪、计算机和图像分析软件三部分，各组份具体叙述如下
第一部分，三维激光扫描仪。本发明优选采用日本产的RolandLPX-1200三维激光扫描仪，有效扫描范围为130.0 mm(直径)x
203.2mm (高)，在旋转方向扫描精度最高可达0.18Q，在上下移动方向精度最高可达0.1mm。三维激光扫描仪LPX-1200内设有一个旋转台的，旋转台上放置要扫描的植物，放置时需要注意使要扫描的物体中心与旋转台的中心对齐，扫描时旋转台带着植物一起旋转，三维激光扫描仪利用精确的非接触式激光传感器进行扫描，通过发射激光束到要扫描的植物根系表面，由传感器探测从物体表面反射的光量来测定物体的坐标，速度快、精度高、操作灵活。
第二部分，计算机。计算机的配置需要Pentium 4以上，内存1GB以上，Windows XP系统，以保证图像分析系统顺利进行。
第三部分，图像分析软件。包括图像采集、重建和模拟，利用三维激光扫描仪结合三维激光扫描仪系统的Dr.PICZA3软件采集植物根系三维构型图像，采集时间随扫描植株根系的大小和扫描精度的不同而不同。根系越大、精度越高，采集的时间就越大。 一般发芽后6
天的大豆根系采用扫描精度在旋转方向为0.18G，在上下移动方向精度为0.1mm时，图像扫描时间需要60分钟左右。发芽后12天的大豆根系采用以上相同的精度扫描时需要90分钟左右。
由于三维激光扫描仪获得的数据是在三维空间中无规则、随机分布的。其特点是数据量庞大、噪声点多、数据密集、数据点散乱分布(因此称为"点云"数据)，表面存在一些"沙洞"。若采用传统的样条编辑方法模拟，模拟结果不是很理想，不适合直接用于后续曲面重构，本发明利用基于广义Hough变换原理的算法对获得的图像进行重建。根据根系的线状特征和天然的连续缓变特征，由各根的中轴线即骨架来刻画根系构型特征，并利用多节点B样条曲线插值，进行植物根系曲面拟合。 本发明的有益效果是本发明提供适宜的培养基组成和生长容器，实现植物的根系在透明的生长环境中自然生长，通过对植物根系原位生长状况进行三维可视化分析，能直接反映根系的三维生长状况，不需要破坏性的检测，并实现动态的观测。本发明方法简单有效，对植物根系三维构型进行原位图像重建和动态模拟以及根构型参数的定量计算，实现植物根系三维构型的原位动态定量描述和分析，为研究植物根系生长及其营养生理功能提供新的科学技术和手段，并可以通过对植物根系三维构型的图像重建和模拟，大大縮短根系生长研究所需的时间。
图l本发明透明的栽培容器结构示意图
图2播种时的种胚朝向示意图
图3三维激光扫描仪扫描根系方式
图4传统的样条编辑方法模拟结果
图5传统的样条编辑方法模拟结果局部放大图
图6传统的样条编辑方法模拟结果
图7大豆发芽后第18天三维激光扫描获取的根系三维构型图像图8水稻发芽后第18天三维激光扫描获取的根系三维构型图像图9大豆发芽后第18天的植物根系三维构型模拟结果图10水稻发芽后第18天的植物根系三维构型模拟结果图11 16水稻根系生长6、 12和18天的形态构型数据框图
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。本发明改变了现有技术破坏性观察和测定根系形态构型的观念，通过大量长期的实验总结得到本发明的设计，实现了对植物根系动态的原位观察和测定。实验中的实施例不能一一赘述，下述实施例仅用于辅助说明本发明思路，并不因此将本发明的范围限定于大豆和水稻。实施例1大豆根系的形态构型的原位观察和测定(1)设计透明的栽培容器和生长介质；
如附图1所示，采用一透明圆柱形有机玻璃容器l，高20cm，直径12cm，设置有一个可打开的盖子2，盖子中间设一个直径为20mm
的贯穿圆洞3;
透明培养基为改良的1/2 Hoagland营养液+ 0.15 %的Phytagel (W/V) +不同磷处理，所述不同磷处理包括无磷处理或l.OmM KH2P04处理，参照本领域技术人员常规技术，pH值调节为5.8，按照常规技术采用盐酸或氢氧化钠等试剂进行调节。
1/2 Hoagland营养液组成为(^M): KN03 2.5xl03， MgS04 '7H20lx103， Ca(N03)2 2.5xl03， ZnS04 7H20 0.38， K2S04 0.25xl03，CuS04 '5H20 0.57， Fe-EDTA(Na) 82， H3B03 23.13， MnCl2 '4H20 4.57，(NH4)6Mo7024 4H20 0.09。
如附图1所示，每个有机玻璃容器分别装15cm高的培养基4，即约1.7L培养基，以使容器内上方留有部分空间5供幼苗早期无菌生长。培养基配置步骤如下
(A)用搅拌机将培养基搅拌均匀，并调节pH值为5.8;有机玻璃容器用紫外线灭菌1小时备用；(B) 采用高压灭菌锅将培养基在12rC灭菌30分钟，灭菌结
束尽快(保证培养基未开始凝固)将培养基倒入灭菌的有机玻璃容器
内，以上操作在超净工作台进行；
(C) 静置冷却待培养基凝固，大概需要4小时左右。其中， 在培养基快凝固时，不能挪动容器，以防止培养基凝固后里面产生气 泡。
对于分层磷处理培养基，需等下层培养基完全凝固后再倒上层 培养基，并确保上层培养基倒入时的温度不能太高，但也不能太低以 至于上层培养基会开始凝固，本发明优选设定上层培养基倒入时温度 为5(TC左右，以保证下层培养基不会没有融化，上层培养基不会很 快发生凝固。
(2)种子灭菌和催芽，出芽后移苗到步骤(1)所述透明的栽培 容器，保持植物根系在所述透明的生长介质中自然生长；
种子在播种前必须要进行灭菌以防止生长过程中产生污染。 大豆种子灭菌与催芽的方法是将大豆种子用10%双氧水浸泡 30分钟，并不时摇动，再用无菌水冲洗3 5次，播种到经过高温灭 菌并含有大豆培养基的培养皿里萌发，注意播种时的种胚朝向如附图 2所示，使胚根向下生长，附图2中6为胚胎(embryo) ， 7为胚根 (radicle)。播种应在超净工作台中操作，播入种子后用透气胶带封 口。在25C培养箱里暗培养24小时左右，出芽后移苗到圆柱形有机 玻璃容器内。
大豆幼苗生长期间的平均温度为白天28"，晚上19匸，相对度为80%，光照时间为12小时。
采用三维激光扫描仪对根系进行扫描，进行根系三维构型的原位 观察和图像捕获。
根系图像三维激光扫描从移苗后第1天到第20天每24小时利 用三维激光扫描仪(Roland LPX-1200， Japan)扫描植株根系一次。 扫描范围为0fl 360G，旋转方向的扫描精度为0.18G，上下移动方向 的扫描精度为O.lmm。
植物根系三维构型原位动态重建及模拟系统由三维激光扫描仪、 计算机和图像分析软件三部分组成。各组份具体功能如下
第一部分，三维激光扫描仪。采用日本产的Roland LPX-1200三 维激光扫描仪，有效扫描范围为130.0 mm(直径)x 203.2mm (高)，在
旋转方向扫描精度最高可达0.18Q，在上下移动方向精度最高可达 O.lmm。三维激光扫描仪LPX-1200内设有一个旋转台，旋转台上放 置要扫描的植物，放置时需要注意使要扫描的物体中心与旋转台的中 心对齐，扫描时旋转台带着植物一起旋转，扫描方式见附图3。三维 激光扫描仪利用精确的非接触式激光传感器进行扫描，通过发射激光 束到要扫描的植物根系表面，由传感器探测从物体表面反射的光量来 测定物体的坐标，速度快、精度高、操作灵活。
第二部分，计算机。计算机的配置需要Pentium 4以上，内存1GB 以上，Windows XP系统，以保证图像分析系统顺利进行。
第三部分，图像分析软件。包括图像采集、重建和模拟，利用三 维激光扫描仪结合三维激光扫描仪系统的Dr.PICZA3软件(RolandLPX-1200, Japan)采集植物根系三维构型图像，采集时间随扫描植 株根系的大小和扫描精度的不同而不同。根系越大、精度越高，采集 的时间就越大，本领域技术人员根据具体需要确定扫描时间。 一般发 芽后6天的大豆根系采用扫描精度在旋转方向为0.18G，在上下移动 方向精度为0.1mm时，图像扫描时间需要60分钟左右。发芽后12 天的大豆根系采用以上相同的精度扫描时需要90分钟左右。按照本 发明方法对大豆发芽后第18天三维激光扫描获取的根系三维构型图 像见附图7。
由于三维激光扫描仪获得的数据是在三维空间中无规则、随机分 布的。其特点是数据量庞大、噪声点多、数据密集、数据点散乱分布 (因此称为"点云"数据)，表面存在一些"沙洞"。若采用传统的 样条编辑方法模拟，模拟结果不是很理想，见附图4 6所示，不适 合直接用于后续曲面重构，附图4三维激光扫描仪获取的离散点； 附图5中植物根系存在的"沙洞"，附图6表示利用传统样条编辑方 法模拟得到的结果。本发明利用基于广义Hough变换原理的算法对 获得的图像进行重建。根据根系的线状特征和天然的连续缓变特征， 由各根的中轴线即骨架来刻画根系构型特征，并利用多节点B样条 曲线插值，进行植物根系曲面拟合。按照本发明方法对大豆发芽后第 18天的植物根系三维构型获得的模拟结果见附图9所示。 实施例2水稻根系的形态构型的原位观察和测定 (1)设计透明的栽培容器和生长介质；
采用一透明圆柱形有机玻璃容器，高20cm，直径12cm，设置有一个可打开的盖子，盖子中间设一个直径为20mm的贯穿圆洞；
水稻培养基为Yoshida在1976年改良的水稻营养液+ 0.15% 的PhytagelTM (W/V) +不同磷处理，所述不同磷处理包括无磷处理 或1.0mM KH2P04处理，参照本领域技术人员常规技术，pH值调节 为5.7，按照常规技术采用盐酸或氢氧化钠等试剂进行调节。
Yoshida等1976改良的水稻营养液组成为(pM) : H3B03 19, Ca(N03)2 4H20 1000, NH4 N03 429, (NH4)6Mo7024 4H20 0.52， MnS04 *H20 9.1, CuS04'5H20 0.16， ZnS04'7H20 0.15, K2S04 513, MgS04 7H20 1667, Fe-EDTA(Na) 36。
每个有机玻璃容器分别装15cm高的培养基，即约1.7L培养基， 以使容器内上方留有部分空间供幼苗早期无菌生长，培养基配置步骤 同实施例1。
(2)种子灭菌与催芽 水稻种子用10%双氧水浸泡60分钟，并不时摇动，再用无菌 水冲洗3 5次；然后再用70%酒精浸泡10分钟，用无菌水冲洗3 5次。浸于无菌水中，放置在28"C培养箱里暗培养48小时左右出芽 后移苗。
水稻幼苗生长期间的平均温度为白天28。C，晚上19"C，相对湿 度为80%，光照时间为12小时。
(3)根系图像三维激光扫描从移苗后第1天到第20天每24 小时利用三维激光扫描仪(Roland LPX-1200， Japan)扫描植株根系 一次。扫描范围为0° 360Q，旋转方向的扫描精度为0.18Q，上下移动方向的扫描精度为O.lmm。植物根系三维构型原位动态重建及模拟
系统由三维激光扫描仪、计算机和图像分析软件三部分组成。各组份
具体功能如下
第一部分，三维激光扫描仪。采用日本产的Roland LPX-1200三 维激光扫描仪，有效扫描范围为130.0 mm(直径)x 203.2mm (高)，在
旋转方向扫描精度最高可达0.18Q，在上下移动方向精度最高可达 O.lmm。三维激光扫描仪LPX-1200内设有一个旋转台，旋转台上放 置要扫描的植物，放置时需要注意使要扫描的物体中心与旋转台的中 心对齐，扫描时旋转台带着植物一起旋转，扫描方式见附图3。三维 激光扫描仪利用精确的非接触式激光传感器进行扫描，通过发射激光 束到要扫描的植物根系表面，由传感器探测从物体表面反射的光量来 测定物体的坐标，速度快、精度高、操作灵活。
第二部分，计算机。计算机的配置需要Pentium 4以上，内存1GB 以上，Windows XP系统，以保证图像分析系统顺利进行。
第三部分，图像分析软件。包括图像采集、重建和模拟，利用三 维激光扫描仪结合三维激光扫描仪系统的Dr.PICZA3软件(Roland LPX-1200, Japan)采集植物根系三维构型图像，采集时间随扫描植 株根系的大小和扫描精度的不同而不同。根系越大、精度越高，采集 的时间就越大。 一般发芽后6天的水稻根系采用扫描精度在旋转方向 为0.18Q，在上下移动方向精度为0.1mm时，图像扫描时间需要40 分钟左右。发芽后12天的水稻根系采用以上相同的精度扫描时需要 90分钟左右。按照本发明方法对水稻发芽后第18天三维激光扫描获取的根系三维构型图像见附图8。
由于三维激光扫描仪获得的数据是在三维空间中无规则、随机分 布的。其特点是数据量庞大、噪声点多、数据密集、数据点散乱分布 (因此称为"点云"数据)，表面存在一些"沙洞"。若采用传统的样 条编辑方法模拟，模拟结果不是很理想，见附图4 6所示，不适合 直接用于后续曲面重构，附图4三维激光扫描仪获取的离散点；附 图5中植物根系存在的"沙洞"，附图6表示利用传统样条编辑方法
模拟得到的结果。本发明利用基于广义Hough变换原理的算法对获
得的图像进行重建。根据根系的线状特征和天然的连续缓变特征，由
各根的中轴线即骨架来刻画根系构型特征，并利用多节点B样条曲
线插值，进行植物根系曲面拟合，按照本发明方法对水稻发芽后第
18天的植物根系三维构型获得的模拟结果见附图IO所示。
采用本发明方法得到的水稻根系生长6、 12和18天的形态构型 数据框图见附图11 16。图中每个柱子所代表的数据为4个重复的 平均及其标准差，每个柱子上字母不相同表示差异显著(<0.05)，字 母相同则表示差异不显著。
权利要求
1、一种植物根系原位动态观察和测定方法，其特征在于包括以下步骤(1)设计透明的栽培容器和生长介质；(2)种子灭菌和催芽，出芽后移苗到步骤(1)所述透明的栽培容器，保持植物根系在所述透明的生长介质中自然生长；(3)采用三维激光扫描仪对根系进行扫描，进行根系三维构型的原位观察和图像捕获，完成图像采集、重建和模拟。
2、 根据权利要求1所述植物根系原位动态观察和测定方法，其 特征在于步骤(3)所述扫描的方法是从移苗后第1天到第20天每 24小时利用三维激光扫描仪扫描植株根系一次，扫描范围为0° 360Q，旋转方向的扫描精度为0.18Q，上下移动方向的扫描精度为 O.lmm。
3、 根据权利要求1所述植物根系原位动态观察和测定方法，其 特征在于步骤(3)所述重建是利用基于广义Hough变换原理的算法 对获得的图像进行重建。
4、 根据权利要求1所述植物根系原位动态观察和测定方法，其 特征在于步骤(3)所述模拟是根据各植物根的中轴线即骨架来刻画 根系构型特征，并利用多节点B样条曲线插值，进行植物根系曲面 拟合。
5、 一种实现权利要求1所述方法的系统，其特征在于包括三维 激光扫描仪、计算机和图像分析软件；所述三维激光扫描仪为RolandLPX-1200三维激光扫描仪；所述计算机的配置为Pentium 4以上，内 存1GB以上，使用Windows XP系统。
全文摘要
本发明公开了一种植物根系原位动态观察和测定方法，包括设计透明的栽培容器和生长介质；种子灭菌和催芽，出芽后移苗到透明的栽培容器中保持植物根系在所述透明的生长介质中自然生长；采用三维激光扫描仪对根系进行扫描，进行根系三维构型的原位观察和图像捕获，完成图像采集、重建和模拟等步骤。本发明通过对植物根系原位生长状况进行三维可视化分析，直接反映根系的三维生长状况，不需要破坏性的检测，并实现动态的观测。
文档编号A01G7/00GK101658107SQ20091019245
公开日2010年3月3日 申请日期2009年9月18日 优先权日2009年9月18日
发明者严小龙, 红 廖, 方素琴 申请人:华南农业大学