注射果蝇属胚胎的利记博彩app

专利名称：注射果蝇属胚胎的利记博彩app
注射果蝇属胚胎相关申请案本申请案主张2007年11月20日申请的美国专利申请案 U. S. S. N. 11/943, 180 ( "‘ 180申请案”)的优先权。'180申请案的全部内容以引用的方 式并入本文中。
背景技术：
1982 年，杰拉尔德·鲁宾(Gerald Rubin)和艾伦·斯布拉丁(Allan Spradling) 报导了通过注射具有转座因子载体的胚胎来实现果蝇属(Drosophila)遗传转化的系统的 发展(参见斯布拉丁和鲁宾，1982，科学(Science)，218 :341 ；和鲁宾和斯布拉丁，1982，科 学，218 348 ；都以引用的方式并入本文中)。此项工作仍然是分子生物学中胚胎的研究之 一。实际上，25年后，转化果蝇属的技术实质上仍然未发生改变。然而，尚有改进的空间。用不同的核酸制剂观测到广泛变化的成功率，且此过程为 劳动密集的。一般说来，一次只有少数胚胎可获得处理，因此“高通量”果蝇属转化是不可 能的。目前，正在尝试使果蝇属注射过程中的某些步骤自动化；研究人员已经指出，如果 可以研发出自动化系统，那么其希望能够实现2. 5小时内高达350个胚胎的注射速率。因此，所属领域中需要有效地注射果蝇属胚胎而无需自动化的系统和方法。所属 领域中需要注射果蝇属胚胎且增加所注射胚胎的存活率和转化率的系统和方法。

发明内容
本发明提供一种快速且有效地将核酸引入果蝇属胚胎中，从而允许可靠地同时处 理多个胚胎的系统。本发明系统可允许快速地处理大量胚胎。举例来说，在一些实施例中， 本发明提供允许每分钟注射约8至10个胚胎的多重系统(multiplexed system)。在一些 实施例中，每分钟可注射超过10个胚胎(例如11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、 18个、19个、20个或更多)胚胎(例如，如果多个个体同时将胚胎排成行进行注射)。在一 些实施例中，本发明的多重系统可实现所注射胚胎的高达约50%百分比注射存活率。在一 些实施例中，生育率高达所注射存活者的85% -90%。在一些实施例中，本发明的多重系统 实现所注射胚胎的高达约80%注射转化率。在一些实施例中，存活率视所注射核酸的尺寸而定。在一些实施例中，存活率取决 于是利用随机插入基因组中(例如P因子介导的插入)的核酸还是利用以位点特异性方式 插入基因组中(例如6C31介导的转化)的核酸来尝试转化。举例来说，对于在约28kb至 约30kb范围内的核酸构建体，在本发明的多重策略中利用Φ C31整合酶系统可使所有所注 射胚胎的约30 %至约70 %为可育存活者。相比之下，在其它转化策略下利用cpC31整合酶系 统的人通常报导所有所注射胚胎的约20%至约50%为可育存活者。在本发明的多重策略中利用P因子介导的系统和在相同尺寸范围内的核酸可使 所有所注射胚胎的约30%至约70%为可育存活者。相比之下，在其它转化策略下利用P因子介导的系统的人通常报导所有所注射胚胎的约30%至约50%为可育存活者。对于甚至大于约30kb的构建体，随机转化与位点特异性转化下的存活率皆减小。 然而，随机插入系统的存活率减小比位点特异性插入系统快得多。对于小于约28kb的构建体，利用本发明策略可使所有所注射胚胎的约30%至约 70%为可育存活者。相比之下，利用其它转化系统的人通常报导所有所注射胚胎的约10% 至约50%为可育存活者。
对于小于约28kb的P因子构建体，利用本发明的多重策略可使所有所注射胚胎的 约30%为转化体。值得注意的是，利用传统方法进行P因子介导的转化可使所有所注射胚 胎的约30%为转化体。对于大于约30kb的P因子构建体，本发明方法和/或传统方法使转 化率适度至显著减小。对于具有低于约40kb的任何尺寸的整合酶构建体，利用本发明的多重策略可使 所有所注射胚胎的约20%至约85%为转化体。值得注意的是，当整合酶以转基因的形式提 供时，利用传统方法进行整合酶介导的转化可使所有所注射胚胎的约20%至约80%为转 化体(比肖夫(Bischof)等人，2007，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA), 104 3312 ；以引用的方式并入本文中)。对于具有低于约40kb的任何尺寸的整合酶构建 体，当整合酶以mRNA分子的形式提供时，利用传统策略可使所有所注射胚胎的约10%为转 化体(维根(Venken)等人，2006，科学，314 1747 ；以引用的方式并入本文中)。对于大于约40kb或约50kb的整合酶构建体，当整合酶以mRNA分子的形式提供 时，利用传统方法进行整合酶介导的转化可使所有所注射胚胎的约2%至约4%为转化体 (维根(Venken)等人，2006，科学，314 1747 ；以引用的方式并入本文中)。利用整合酶介导 的方法，使用本发明的多重系统和方法，可注射约IOOkb或甚至更大的构建体且可产生显 著增加数目的转化体(例如超过10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或更多)。因此，本发明提供转化果蝇属胚胎的系统和方法，其更快、通量更高且可更大规模 地进行。本发明的多重系统和方法的转化频率等于或大于传统(例如非多重)方法。本发 明提供允许实质上增加果蝇属胚胎转化效率(例如，如通过每分钟注射时间的转化体数目 来测量)的系统和方法。本发明代表对传统方法的显著改进。在一些实施例中，存活率和转化率可视注射至果蝇属胚胎中的特定核酸而 定。在一些实施例中，转化率可视所注射构建体的核苷酸序列而定。在一些实施例中， 转化率可视载体的核苷酸序列而定。举例来说，本发明涵盖以下认知，即具有绝缘序列 (insulatorsequence)的构建体的转化率通常低于不具有绝缘序列的构建体。在一些实施 例中，转化率可视插入特定载体中的核苷酸序列而定。举例来说，插入特定载体中的核苷酸 序列X可能或多或少比插入同一载体中的核苷酸序列Y有效地转化。关于DNA序列可影响 转化率的实例，参见格林布拉特(Grinblat)等人(1994，发育(Development)，120 91 ；以 引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，用于整合酶介导的转化的方法利用所注射mRNA作为整合酶来 源(参见例如格罗思(Groth)等人，2004，遗传学(Genetics)，166 1775 ；和费希(Fish)等 人，2007，自然实验手册(Nat. Protocols)，2 :2325 ；都以引用的方式并入本文中)。在一些 实施例中，用于整合酶介导的转化的方法将种系特异性转座(transpose)用于整合酶来源 (参见例如比肖夫(Bischoff)等人，2007，美国国家科学院院刊，104:3312;以引用的方式并入本文中)。本发明的系统和方法利用nanos-整合酶(nanos-integrase)转基因(比 肖夫(Bischoff)等人，2007，美国国家科学院院刊，104 3312 ；以引用的方式并入本文中)。 本发明涵盖以下认知，即通过表达转基因的整合酶提供整合酶使得转化率比以所注射mRNA 的形式提供整合酶的情况下高。本发明尤其提供允许快速且可靠地制备注射质量的核酸样品的方法和试剂。另 夕卜，本发明提供一种用于所述核酸制备的多重系统，使得可同时制备多个(例如96个或更 多)注射质量的核酸样品。本发明也提供一种在板中大规模处理DNA以快速处理所注射的果蝇属胚胎的系 统，且特别是提供将多个所注射胚胎同时转移至足以支持孵化和起始幼体发育的生长培养 基中的方法和试剂。或者或另外，在一些实施例中，可使用“处女(virginator) ”品系来增 加建立产生注射用卵所需的杂交和筛选转化体所需的杂交的效率。



具体实施例方式定义约除非另外说明或从上下文其它地方显而易见，否则如本文所用，关于数目的术 语“约”(approximately、about) —般包括在此数目的5%、10%、15%或20%范围内(在 大于或小于中的任一方向上)的数目(除了所述数目小于可能值的0%或超过可能值的 100%的情况)。注射质量的核酸如本文所用，术语“注射质量的核酸”是指在细胞化之前注射至 果蝇属胚胎中时允许超过50%的胚胎存活的核酸制剂。一般说来，注射质量的核酸的特征 在于实质上不含醇(例如乙醇、异丙醇等)、RNA、蛋白质和/或颗粒物质且允许25% -50% 或更多的所注射胚胎存活。核酸如本文所用，术语“核酸”广义上是指任何并入或可并入寡核苷酸链中的化 合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是通过磷酸二酯键并入寡核苷酸链中或可通过磷 酸二酯键并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是指个别核酸 残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核 苷酸链。如本文所用，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。在一些实施例中，“核 酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/ 或类似术语包括核酸类似物，即具有非磷酸二酯骨架的类似物。举例来说，所属领域中已知 且骨架中具有肽键而非磷酸二酯键的所谓“肽核酸”被视为在本发明的范围内。术语“编 码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷 酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可包括内含子。核酸可从天然来源纯化，使 用重组表达系统产生且任选纯化，以化学方法合成等。适当时，例如在以化学方法合成分 子的状况下，核酸可包含核苷类似物，例如具有经化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似 物。除非另外指示，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。本文中，术语“核酸区段”用以指 作为较长核酸序列的一部分的核酸序列。在多个实施例中，核酸区段包含至少3个、4个、5 个、6个、7个、8个、9个、10个或更多残基。在一些实施例中，核酸是或包含天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例 如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞 苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿 苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、 8_氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷和2-硫代胞苷)；以化学方法修饰的碱基；以生物学方法修饰 的碱基(例如甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如2' _氟核糖、核糖、2'-脱氧 核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5 ‘ -N-亚磷酰胺 键)。在一些实施例中，核酸是注射至果蝇属胚胎中的DNA分子。在一些实施例中，核酸是 注射质量的核酸。在一些实施例中，核酸不是注射质量的核酸。实质上如本文所用，术语“实质上”是指显示全部或接近全部程度(extent、 degree)的相关特征或性质的定性条件。生物领域的一般技术人员应了解，生物和化学现象 即使存在也很少会进行至结束和/或进行完整或达到绝对结果，或避免绝对结果。因此，本 文中术语“实质上”用以填补许多生物和化学现象中所固有的完整性的潜在缺乏。载体如本文所用，“载体”是指核酸分子，其能够输送所连接的另一核酸。如本文 所用，术语“载体”一般是指能够整合至宿主细胞的基因组中的核酸分子。在一些实施例中， 载体在酶(例如转座酶、整合酶、重组酶等)的帮助下整合至宿主细胞的基因组中。能够指 导可操作连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。在一些实施例中，载体一旦 整合至宿主细胞的基因组中，即可指导可操作连接的基因的表达。在一些实施例中，载体随 机整合至宿主细胞的基因组中(例如基于P因子的载体)。在一些实施例中，载体在特异性 位点处整合至宿主细胞的基因组中(例如整合酶介导的载体)。在一些实施例中，载体整合 至宿主细胞的基因组中以达成遗传转化的目的。描述某些实施例本发明提供允许可靠地多重转化果蝇属胚胎的系统。本发明尤其提供允许制备注 射质量的核酸样品且特别是允许同时制备多个所述样品的方法和试剂。本发明也提供同时 处理多个所注射胚胎的系统。通过胚胎注射来转化果蝇属一般说来，果蝇属转化是将外源性DNA序列引入果蝇属种系中的过程。根据本发 明，可利用任何可整合至果蝇属种系中的核酸。可用于果蝇属转化的例示性核酸载体呈现 于表1中。P因子介导的转化在一些实施例中，果蝇属转化使用P因子进行。P因子是存在于黑腹果蝇 (Drosophilamelanogaster)中的转座子且广泛用于诱变和产生经遗传修饰的蝇类。P因 子是第II类转座子，意指其有可能通过转座酶在基因组内移动。结束元件(complete element)为2907bp且是自主的，这是因为其编码功能转座酶；也存在非自主P因子，其因 突变而缺乏功能转座酶基因。如果存在产生转座酶的自主元件，那么非自主P因子仍可在 基因组内移动。P因子可通过存在末端31bp的反向重复序列和移动至DNA序列产物中和从 其中移出的8bp正向重复序列来鉴别。天然存在的P因子通常含有酶转座酶的编码序列和转座酶作用的识别序列。转座酶是一种调节和催化P因子从宿主DNA切除，在两个识别位点处切割，且接着随机再插入的酶。一般说来，为使用P因子作为适用和可控制的遗传工具，将P因子的两部分分离以防止 转座作用不受控制。因此，正常的遗传工具是没有转座酶识别序列、因而无法插入的编码转 座酶的DNA，和P因子构建体。P因子构建体通常包含适用于选择转化体的报道基因(例如 白色+、黄色+等)和转座酶识别序列。P因子构建体可能另外包含相关基因、细菌报道基因 (例如编码抗生素抗性的基因)、复制起点等。用于果蝇属转化的含有P因子的构建体通常是大DNA载体。在一些实施例中，用于 果蝇属转化的含有P因子的构建体为至少约10个千碱基(kb)、至少约15kb、至少约20kb、 至少约25kb、至少约26kb、至少约27kb、至少约28kb、至少约29kb、至少约30kb、至少约 3Ikb、至少约32kb、至少约33kb、至少约34kb、至少约35kb、至少约36kb、至少约37kb、至少 约38kb、至少约39kb、至少约40kb、至少约41kb、至少约42kb、至少约43kb、至少约44kb、 至少约45kb、至少约46kb、至少约47kb、至少约48kb、至少约49kb或至少约50kb(哈恩林 (Haenlin)等人，1985，细胞(Cell)，40 :827 ；以引用的方式并入本文中)。位点特异件转化和大核酸的转化 虽然随机P因子整合适用于基因功能研究(欧肯(0' Kane)和格林(Gehring)， 1987，美国国家科学院院刊，84 9123 ；和斯布拉丁 (Spradling)等人，1999，遗传学，153 135 ；都以引用的方式并入本文中)，但是位置效应可强烈地影响基因表达，从而使表型分 析复杂化(李维斯(Levis)等人，1985，科学，229 558 ；以引用的方式并入本文中)。通常， 75%以上的P因子插入基因的调节元件中(拜伦(Bellen)等人，2004，遗传学，167 761 ；以 引用的方式并入本文中)，常常以微妙的方式破坏基因(诺迦(Norga)等人，2003，当代生物 学(Curr. Biol. )，13:1388;以引用的方式并入本文中)。因此，在一些实施例中，需要能够 将基因插入相同染色体位置处。在一些实施例中，使用允许位点特异性整合外源性核酸物 质的系统和/或方法使果蝇属转化。另外，目前涉及P因子介导的转化的方法受DNA尺寸限制，这阻碍大基因(> 40kb)和基因复合物的研究。在一些实施例中，这是由于普遍难以操作大DNA片段。在一 些实施例中，这是由于难以将大DNA片段转移至蝇基因组中。因此，在一些实施例中，需要 能够转化具有大核酸分子的果蝇属。在一些实施例中，使用允许转化大核酸分子的系统和 /或方法使果蝇属转化。在一些实施例中，本发明策略允许成功地转化P因子构建体大于 40kb (例如高达约80kb的粘粒，[参见例如李(Lee)等人，2001，基因组学(Genomics), 73 56;以引用的方式并入本文中])的果蝇属。在一些实施例中，允许位点特异性整合的系统 和/或方法也允许转化大核酸分子。在一些实施例中，使用piggyBac元件使果蝇属转化。piggyBac元件是一种短 的反向末端重复(ITR)转座因子，其为约2. 5kb长且包含13bp的ITR序列和2. Ikb的 ORF (爱利克(Elick)等人，1995，遗传学(Genetica)，97 127 ；和宾姆斯(Beames)和萨默斯 (Summers)，1990，病毒学(Virology)，174 354 ；都以引用的方式并入本文中)。其是专门插 入TTAA标靶位点中的ITR元件的子类的一部分(宾姆斯(Beames)和萨默斯(Summers)， 1990，病毒学(Virology), 174 354 ；菲舍(Fraser)等人，1995，病毒学，211 397 ；和王 (Wang)和菲舍(Fraser)，1993，昆虫分子生物学(Insect Mol. Biol.)，1 :109 ；都以引用的 方式并入本文中)。插入后，复制标靶位点，并且切除只能以准确的方式进行，从而恢复插入 位点。除此功能相似性外，TTAA元件未共享明显的结构一致性。已展示piggyBac载体介导昆虫物种中的种系转化。已研发一种涉及Cre和FLP的系统，其允许研究两个在基因组中相同位置处的基 因(思高(Siegal)和哈尔特(Hartl)，1996，遗传学(Genetics)，144 715 ；和思高(Siegal) 和哈尔特(Hartl)，2000，分子生物学方法(Methods Mol. Biol.)，136 :487 ；都以引用的方 式并入本文中)。在此系统中，由含有两个侧接IoxP或FRT序列的相关转基因的P因子插 入物产生蝇细胞系(fly line)。在Cre表达下，移除一个转基因；而在FLP表达下，移除另 一个转基因。接着，每个保留的转基因置于相同的染色体环境中。在一些实施例中，位点特异性整合问题的解决方法是使用同源重组。一般说来，同 源重组的频率过低，以致在果蝇属中没有实际用途。然而，在一些实施例中，可使用P因子 转化来插入含有待靶向、经I-SceI切割位点工程化且侧接两个FRT位点的基因的构建体， 由此加快同源重组的频率。接着，此构建体可通过FLP表达，以环状DNA分子形式动员，且 通过I-SceI表达，呈线性，从而增加靶向重组频率(容(Rong)和歌莉兹(Golic)，2000，科 学，288:2013;容(Rong)和歌莉兹(Golic)，2001，遗传学，157 1307 ；和容等人，2002，基因 与发育(Genes Dev. ), 16 1568 ；都以引用的方式并入本文中)。在此系统中，携带经I-SceI 和FLP位点工程化的同源DNA的单独P因子插入物为每个待靶向的基因所需。通过此方法， 可获得500-30，000个来自雌性种系的配子中约有1个的频率的靶向事件。理想地，可将插 入物靶向基因组中的任何位置。
在一些实施例中，FLP/FRT系统已用于果蝇属中，将基因插入基因组中的任何所需 位置中。当标靶DNA通过FLP切除从基因组中的其它地方动员时，整合至果蝇属基因组中 的FRT位点中的频率可高达5% (歌莉兹(Golic)等人，1997，核酸研究(Nuc. Acid. Res.), 25 :3665 ；以引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，使用整合酶介导的系统使果蝇属转化(参见例如格罗思 (Groth)等人，2004，遗传学(Genetics)，166 :1775 ；以引用的方式并入本文中)。来自噬 菌体cpC31的位点特异性整合酶(索普(Thorpe)和史密斯(Smith)，1998，美国国家科学院 院刊，95 :5505 ；以引用的方式并入本文中)已展示，在人类和小鼠组织培养细胞中和小鼠 活体内高频率地起作用(格罗思(Groth)等人，2000，美国国家科学院院刊，97:5995;斯 亚珈依(Thyagarajan)等人，2001，分子与细胞生物学(Mol. Cell. Biol. )，21 3926 ；奥利 瓦雷斯(Olivares)等人，2002，自然生物技术(Nat. Biotechnol. )，20 :1124 ；奥兹 乌达 (Ortiz-Urda)等人，2002，自然医学(Nat.Med.)，8 1166 ；奥兹·乌达(Ortiz-Urda)等人， 2003，临床研究杂志(J.Clin. Invest. )，111 251 ；和奥兹 乌达(Ortiz-Urda)等人，2003， 人类基因疗法(Hum. Gene Ther.)，14 923 ；都以引用的方式并入本文中)。cpC31整合酶不 需要辅因子且介导两个序列attB与attP位点之间的重组，从而产生稳定重组体(索普 (Thorpe)和史密斯(Smith)，1998，美国国家科学院院刊，95 :5505 ；以引用的方式并入本文 中)。分子内与分子间重组都高频率地发生，且基本上未发生反应逆转。已经证实，整合酶 可识别人类和小鼠基因组中与attP部分一致的内源性假attP位点并整合至其中(斯亚珈 依(Thyagarajan)等人，2001，分子与细胞生物学(Mol. Cell. Biol. )，21 3926 ；和奥利瓦雷 斯(Olivares)等人，2002，自然生物技术(Nat. Biotechnol. ), 20 1124 ；都以引用的方式并 入本文中)。小鼠和人类的假attP位点通常与野生型attP实现30%至45%—致。在一些实施例中，cpC31整合酶可介导果蝇属中分子内和分子间位点特异性重组高频率地进行。在一些实施例中，通过将与整合酶mRNA —起注射的含attB质粒整合至果蝇 属胚胎中，可在含有attP的蝇细胞系中产生转基因蝇。如上文所提及，P因子介导的转化的局限性在于不能利用大核酸构建体。一般说 来，在例如典型P因子载体等高拷贝数质粒中克隆大DNA片段效率较低，这是因为大片段在 细菌中在高拷贝数下不稳定。因此，研发低拷贝数载体，包括Pl (斯滕伯格(Sternberg)， 1990，美国国家科学院院刊，87 :103 ；以引用的方式并入本文中)和细菌人工染色体(BAC) (谷口(Shizuya)等人，1992，美国国家科学院院刊，89 :8794 ；以引用的方式并入本文中) 载体，以稳定地维持大的克隆DNA片段。不幸地，低拷贝数载体会阻碍定序、胚胎注射和其 它需要大量质粒DNA的操作。一种已研发出的解决方法包含可有条件扩增的质粒，其具有 两个复制起点(ori)用于低拷贝繁殖的oriS，其典型用于Pl和BAC载体；和oriV，其可通 过实验方法诱发，达高拷贝数(维尔德(Wild)等人，2002，基因组研究(Genome Res.), 12 1434;以引用的方式并入本文中)。因此，将可有条件扩增的BAC特征引入蝇转化载体中， 以便于在果蝇属中操作大DNA片段。
克隆大DNA片段受到常规方法限制，这些方法依赖于限制酶和DNA连接酶，从而 阻碍对大基因和基因复合物的分析。近来，已发展有效的活体内克隆技术，其使用增强和 经调节的重组系统，通常称为“重组工程”(科普兰(Copeland)等人，2001，遗传学自然评 论(Nat. Rev. Genet. ),2 769 ；以引用的方式并入本文中)。重组工程促进通过缺口修复和 随后定位诱变回收DNA片段。因为重组工程是基于同源重组，所以无需限制酶和DNA连接 酶。小鼠遗传学家广泛使用重组工程以产生转基因和基因敲除的构建体。重组工程介导的 诱变在低拷贝质粒下较为有效(科普兰(Copeland)等人，2001，遗传学自然评论(Nat. Rev. Genet.), 2769 ；以引用的方式并入本文中)。因此，在可有条件扩增的BAC中使用重组工 程已展示促进大DNA片段的缺口修复和随后在低拷贝数下诱变。因此，已使用基于重组工程的方法来研发克服与P因子介导的转基因有关的局限 性的载体(维根(Venken)等人，2006，科学，314 :1747 ；以引用的方式并入本文中)。维根 (Venken)等人描述用于操作的P/cpC31人工染色体(Pkcman])，它是一种可有条件扩增的 BAC载体，含有用于P-转座酶介导的整合(鲁宾(Rubin)和斯布拉丁(Spradling)，1982， 科学，218:348;以引用的方式并入本文中)与cpC31介导的整合(格罗思(Groth)等人， 2004，遗传学(Genetics)，166 :1775 ；以引用的方式并入本文中)的识别位点。P[acman] 允许任何来自果蝇属Pl或BAC克隆的基因组DNA片段经重组工程介导而进行克隆(金默 里(Kimmerly)等人，1996，基因组研究，6 :414 ；霍金斯(Hoskins)等人，2000，科学，287 2271 ；亚当(Adams)等人，2000，科学，287 2185 ；和希尔尼克(Celniker)等人，2002，基因 生物学(Genome Biol.) 3 :RESEARCH0079 ；都以引用的方式并入本文中)，且使得能够将大 DNA片段转移至蝇基因组中。通过重组工程轻易地操作这些DNA片段并将其引入蝇基因组 中的特异性位点中的能力可促进且加速活体内果蝇属的基因操作。在一些实施例中，相较于目前用于果蝇属转基因的策略，Ptacman]提供改进。在 一些实施例中，使用重组工程介导的缺口修复，可从基因组Pl和BAC克隆中回收大于IOOkb 的DNA构建体。实际上，已报导高达约146kb的片段在界定位点处整合(拜伦(Bellen)等 人，2006，314:1747;以引用的方式并入本文中)。片段回收至装有诱导性oriV复制起点的 质粒中，使得可容易地制备大量DNA用于定序和果蝇属转基因。所回收的片段不需要重新定序，这是因为其是直接从基因组克隆中回收而没有进行PCR扩增。在一些实施例中，不同于P-转座酶，cpC31 -整合酶使得能够将大片段整合至果蝇属基因组中。因为cpC31 -整合酶 催化两个异位附着位点(attB与attP)之间的重组，所以转基因整合在蝇基因组中的特异 性停泊位点处。此基本上消除位置效应的问题，这在比较衍生自相同转基因的不同诱变处 理的构建体以进行结构/功能分析时是非常合乎需要的特征。在一些实施例中，通过重组 工程进行定位诱变在例如Ptacman]等低拷贝质粒中非常有效。在一些实施例中，位点特异性整合系统的停泊位点可更详细地加以表征以确定插 入同一位点的不同基因的表达水平。在一些实施例中，可确定是相邻的增强子还是调节元 件影响每一停泊位点中的基因表达，从而鉴别位点是增强、抑制和/或“中性”的。当插入 过度表达或RNA干扰转基因时，相邻的基因组环境也可能变得重要。在一些实施例中，可将cpC31系统最优化，使其达到可使其适用于大规模转基因方 法的有效性、便利和可扩展性的程度。在一些实施例中，通过改进cpC31整合酶的传递，使系 统更加稳固，并产生贯穿果蝇属基因组四大染色体的良好表征的高效率着陆位点(landing site)文库(比肖夫(Bischoff)等人，2007，美国国家科学院院刊，104:3312;以引用的方 式并入本文中)。比肖夫(Bischof)等人设计这些着陆位点，以便不干扰通常使用的标记 物和转座子系统，且可通过Cre/loxP和attP/attB系统在活体内操作。产生不同的“内源 性”cpC31整合酶来源且使其最优化，以克服共同注射在活体外合成的有帽整合酶mRNA的需 要。这些举措为整合位点的选择和转基因的表达水平提供巨大的灵活性。与通过传统转座 子介导的种系转化所得相比，预定的整合位点有效消除了定位转基因插入物所需要的时间 和工作。界定的attP位点允许准确的活体内结构/功能分析。在一些实施例中，具有大量 着陆位点可便于同时使用多个转基因。另外，比肖夫(Bischof)等人(2007，美国国家科学院院刊，104 3312)描述了种系 特异性cpC31整合酶的建立。存在介导转化的酶的“内源性”来源将此系统与大多数其它通 常用于果蝇属的种系转化方法区别开来。使用<pC31整合酶的转基因来源会消除产生mRNA 所需要的时间和成本，且显著降低与注射过程有关的复杂性，例如由有帽cpC31整合酶mRNA 的质量和稳定性引起的效率变化性。在一些实施例中，此类“内源性”整合酶来源可显著地 增强整合速率。比肖夫(Bischof)等人(2007，美国国家科学院院刊，104 3312)也描述一种整合 系统，此整合系统利用即刻可见的关于特异性attP靶向的读数，且因此将允许快速地选择 准确的整合事件而无需对每个转化体执行PCR反应。具体来说，将白色基因的一大部分(外 显子3-6)放于着陆位点中。剩余部分(启动子和外显子1-2)通过转化载体pwp_Ex2UASTattB 来提供。只有当引入的attB质粒整合至位于外显子2与3之间的白色内含子中的供体attP 位点中时，功能白色基因才重新组成并引起白色功能表达，此表明准确的attP靶向。除用 作特异性指示物外，此白色分裂系统也减小标记物转基因的尺寸且因此减小转化载体的尺 寸，这是一种可便于其处理且另外增加转基因频率的性质。注射质量的核酸熟知果蝇属胚胎注射中利用的核酸制剂的质量在存活率与转化率两方面，对注射 的成功都有着深远的影响。大多数传统的DNA制备方法包含双带CsCl纯化，接着乙醇沉淀。 举例来说，斯布拉丁(Spradling)和鲁宾(Rubin) (1982，科学，218 341 ；以引用的方式并入本文中)报导约7. 4%的所注射胚胎为转化体，且鲁宾(Rubin)和斯布拉丁(Spradling) (1982，科学，218:348)报导介于约O %与约5 %之间的所注射胚胎为转化体。阿森伯纳 (Ashburner) (1989，果蝇属，实验室手册(Drosophila，ALaboratory Manual.)冷泉港出版 社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(NewYork)；以引 用的方式并入本文中)和斯布拉丁(Spradling) (1986，果蝇属实用方法(Drosophila =A Practical Approach) Φ "P(P-Element-MediatedTransformation) %
175-197 页，罗伯茨(D.B.Roberts)编辑，IRL 出版社(IRL Press)，牛津(Oxford))描述利用双带CsCl纯化的DNA时，转化率在10%与20%之间。近来，已经使用更现代的技术(例如凯杰(Qiagen)纯化)来纯化DNA用于P因子 转化(参见例如吉尔托普(Gelstorpe)等人，2006，遗传学(Genetics)，174 265 ；和纽伯格 (Neuburger)等人，2006，遗传学(Genetics)，173 1377 ；都以引用的方式并入本文中)。举 例来说，利用cpC31整合酶系统和更现代的纯化技术，已经报导16%至55%的转化率(格罗 思(Groth)等人，2004，遗传学(Genetics)，166 1775 ；和比肖夫(Bischof)等人，2007，美 国国家科学院院刊，104 3312 ；都以引用的方式并入本文中)。本发明涵盖以下认知，即同时制备多个核酸样品可增加果蝇属注射方案的效率。 本发明涵盖以下认知，即同时制备多个核酸样品用于注射的传统方法不会产生注射质量的 核酸。如本文所用，术语“注射质量的核酸”是指在细胞化之前注射至果蝇属胚胎中时允 许超过50%的胚胎存活的核酸制剂。一般说来，注射质量的核酸的特征在于实质上不含醇 (例如乙醇、异丙醇等)、RNA、蛋白质和/或污染粒子。本发明涵盖以下认知，即不需要高浓度核酸来实现高转化率。在一些实施例中，注 射质量的核酸为约 50ng/y 1、约 75ng/y 1、约 IOOng/μ 1、约 125ng/y 1、约 150ng/y 1、约 175ng/y 1或约200ι^/μ 1。在一些实施例中，注射质量的核酸在约50ng/l·! 1与约IOOng/ μ 1 之间、约 IOOng/μ 1 与约 150ng/y 1 之间、约 150ng/y 1 与约 200ng/μ 1 之间、约 250ng/ μ 1 与约 300ng/ μ 1 之间、约 300ng/ μ 1 与约 400ng/ μ 1 之间、约 400ng/ μ 1 与约 500ng/ μ 1 之间、约 500ng/ μ 1 与约 600ng/ μ 1 之间、约 600ng/ μ 1 与约 700ng/ μ 1 之间、约 700ng/ μ 1 与约 800ng/ μ 1 之间、约 800ng/ μ 1 与约 900ng/ μ 1 之间或约 900ng/ μ 1 与约 IOOOng/ μ 1 之间的范围内。本发明涵盖以下认知，即高于200ng/μ 1的浓度可引导多个插入物。在一 些实施例中，多个插入物不合乎需要。在一些实施例中，多个插入物合乎需要。在一些实施例中，注射质量的核酸包含适于通过注射至胚胎中使果蝇属转化的 DNA载体。表1中包括可用于果蝇属转化的例示性载体。表1.用于果蝇属转化的例示性载体 在一些实施例中，可用于果蝇属转化的例示性载体在https //dgrc. cgb. indiana. edu/vectors/store/vectors. html上列出。所属领域的技术人员将认识到,这是 例示性的不全面的载体清单。任何能够转化至果蝇属中的载体都可根据本发明使用。本发明的核酸可包含天然存在的核苷、经修饰的核苷、在一个或一个以上核苷之间插入烃连接子(例如亚烷基)或聚醚连接子(例如PEG连接子)的天然存在的核苷、在一 个或一个以上核苷之间插入烃或PEG连接子的经修饰的核苷、或其组合。在一些实施例中， 核酸的核苷酸或经修饰的核苷酸可由烃连接子或聚醚连接子置换，只要该核酸的功能特征 实质上未因取代而减少即可。所属领域的技术人员应了解，本发明的核酸可包含完全是天然存在的核酸中所 发现的类型的核苷酸，或可代之以包括一个或一个以上核苷酸类似物，或具有在其它方面 不同于天然存在的核酸的结构。美国专禾IJ 6，403，779,6, 399，754,6, 225，460,6, 127，533、 6，031，086,6, 005，087,5, 977，089和其中的参考文献(都以引用的方式并入本文中)揭示 多种可用于制备合成产生的核酸的特异性核苷酸类似物和修饰。参见库克(Crooke，S.) (编辑)，反义药物技术原理、策略和应用(Antisense Drug Technology principles, Strategies, and Applications) ( M I fik), ^ M/T^ '/K (Marcel Dekker) ； ISBN 0824705661 ；第1版(2001)和其中的参考文献(以引用的方式并入本文中)。举例来说， 2'-修饰包括卤基、烷氧基和烯丙氧基。在一些实施例中，2' -OH基团是由选自H、0R、R、 卤基、SHjRpNHpNH10NR2或CN的基团置换，其中R为C1-C6烷基、烯基或炔基，且卤基为F、 Cl、Br或I。经修饰键的实例包括硫代磷酸酯和5 ‘ -N-亚磷酰胺键。根据本发明，可利用包含多种不同的核苷酸类似物、经修饰的骨架或非天然存在 的核苷间键的核酸。本发明的核酸可包括天然核苷(即腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧 腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或经修饰的核苷。经修饰的核苷酸的实例包括碱 基经修饰的核苷(例如阿糖胞苷(aracytidine)、肌苷、异鸟苷、水粉蕈素(nebularine)、 假尿苷、2，6- 二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-硫代胸苷、3-脱氮-5-氮胞苷、2 ‘-脱氧尿苷、 3-硝基吡咯、4-甲基吲哚、4-硫代尿苷、4-硫代胸苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、2-硫代尿 苷、5-溴胞苷、5-碘尿苷、肌苷、6-氮尿苷、6-氯嘌呤、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氮腺苷、 8-叠氮腺苷、苯并咪唑、Ml-甲基腺苷、吡咯并嘧啶、2-氨基-6-氯嘌呤、3-甲基腺苷、5-丙 炔基胞苷、5-丙炔基尿苷、5-溴尿苷、5-氟尿苷、5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、 8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0 (6)-甲基鸟苷和2-硫代胞苷)、以化学方法或生物学方法修饰 的碱基(例如甲基化碱基)、经修饰的糖(例如2'-氟核糖、2'-氨基核糖、2'-叠氮核 糖、2' -0-甲基核糖、L-对映异构体核苷阿拉伯糖、和己糖)、经修饰的磷酸酯基(例如硫 代磷酸酯和5' -N-亚磷酰胺键)和其组合。在一些状况下，相对于仅由天然存在的核苷酸 组成的核酸，包含这些修饰的核酸显示改进的性质。在一些实施例中，利用本文所述的核酸 修饰来减少和/或防止核酸酶(例如核酸外切酶、核酸内切酶等)消化。举例来说，可通过 在一条或两条链的3'末端包括核苷酸类似物以减少消化，来使线性核酸的结构稳定。经修饰的核酸无需沿整个分子长度均勻地经修饰。不同的核苷酸修饰和/或骨架 结构可存在于核酸中的多个位置处。所属领域的技术人员应了解，核苷酸类似物或其它修 饰可位于核酸的任何位置处，使得核酸的功能实质上未受影响。经修饰区域可位于沿核酸 分子长度的任何位置。一条或两条核酸链可包含至少50%未经修饰的核苷酸、至少80%未经修饰的核苷酸、至少90%未经修饰的核苷酸或100%未经修饰的核苷酸。本发明的核酸可例如包含对糖、核苷或核苷间键的修饰，例如美国专利公开案 2003/0175950,2004/0192626,2004/0092470,2005/0020525 和 2005/0032733 (都以引用的 方式并入本文中)中所述的修饰。本发明涵盖使用任何具有任一个或一个以上其中所述的 修饰的核酸。举例来说，据报导例如脂质(例如胆固醇)、石胆酸、奥瑞酸(aluricacid)或 长烷基支链等大量末端结合物改进细胞吸收。可例如使用所属领域中已知的任何适当分析 来检验类似物和修饰。在一些实施例中，本发明的核酸可包含一个或一个以上非天然的核 苷键。在一些实施例中，一个或一个以上内部核苷酸反向以产生例如3' -3'键或5' -5' 键等键。制备沣射用核酸的传统方法制备注射用核酸的传统方法常常包含使表达相关核酸的微生物培养物生长，使微生物溶解，和使用醇使核酸自细胞溶解产物中沉淀出来。在一些实施例中，方法包含在沉淀 前使溶解产物澄清的步骤。在一些状况下，方法可另外包含过滤步骤。在一些实施例中，通 过溴化乙锭-CsCl梯度离心来制备核酸。或者或另外，存在数个用于同时制备多个DNA样品的市售系统(例如凯杰、密理博 (Millipore)等)。这些方法通常利用96孔板且包含真空过滤或者离心以分离和纯化DNA。举例来说，凯威(QIAwell)系统由3个独立的多孔组件组成，这些组件可个别地或 连续用于真空歧管凯维(QIAvac) 6S和凯维96上。在一些实施例中，所述程序亦可在仿生 机器人(BioRobot) 9600和3000上自动操作。使用凯杰系统，用缓冲液QE从凯威膜上洗 脱质粒DNA(例如，DNA已使用2001年8月凯威8超质粒试剂盒(Ultra Plasmid Kit)和凯 威96超质粒试剂盒的凯威 系统手册(System Handbook)中所述的小规模制备(minipr印) 程序加以纯化)。脱盐和浓缩在凯博(QIApr印)组件中串联进行，这会消除耗时的沉淀和离 心。双链质粒DNA结合至凯博组件的基于硅胶的膜上；通过用缓冲液PE洗涤，有效地去除 盐和其它非DNA组分。使用缓冲液EB，从凯博组件洗脱纯的质粒DNA。洗脱的DNA通常在 5ml LB培养物150ng/ μ 1至200ng/ μ 1的范围内。对于洗脱，最佳真空在_200毫巴(mbar) 与-300毫巴之间，且对于乙醇(缓冲液PE)去除，最佳真空高达最大真空。凯杰方案详细地描述于凯威 系统手册(以引用的方式并入本文中)中。简单地 说，通过施加-200毫巴与-300毫巴之间的真空，使核酸吸附至凯博膜上，直到所有溶液都 通过为止。关掉真空，且使用-200毫巴与-300毫巴之间的真空，用2 X Iml缓冲液PE洗涤 每个孔。在缓冲液PE完全转移后，真空继续1分钟。通过在一堆吸水纸上有力地轻拍凯博 板，去除缓冲液PE的所有痕迹。如果可获得96孔微孔板离心机，那么去除乙醇的较方便方 法可为离心。标准96孔微孔板分接至凯博96板的底部，且在1300Xg下离心1分钟。将凯博96板放回到歧管上，施加最大真空1分钟，通风，且重复缓冲液去除程序。 重复此程序将去除在第一步骤中从孔壁掉下的任何液滴。真空和分接步骤交替进行，直到 在吸水纸上不再观测到其它缓冲液PE斑点为止。将凯博96板放回到歧管上且再施加最大 真空5分钟。此步骤意指从膜蒸发任何残留的乙醇。移出废盘且用含有1. 2ml收集微管的微管架替换。将歧管重新装配，确保凯博96 板与收集微管适当对准。75 μ 1缓冲液EB(10mM Tris-Cl,pH 8. 5)加入每个孔的中心中， 且通过施加-200毫巴与-300毫巴之间的真空达30秒来洗脱DNA。真空增至-600毫巴，持续30秒。用另一份75 μ 1缓冲液重复真空循环。在洗脱期间增加真空将使保留在凯博膜 上的洗脱缓冲液的量减到最小，且使质粒DNA的回收达到最大程度。在一些实施例中，可使 用凯维96或者微量滴定板离心机将DNA样品洗脱至微量滴定板中。为通过离心进行洗脱， 标准96孔微孔板分接至凯博96板的底部，且在1300 X g下离心1分钟。使用凯博方案，高 拷贝质粒的DNA产量将为每毫升起始培养物约4 μ g-5 μ g。如果质粒DNA欲通过干燥进行 浓缩，那么用ImM pH 8. 5的Tris · Cl或pH > 7. 0的H2O洗脱DNA。使用密理博系统，通过施加真空来洗脱质粒DNA(例如，DNA已使用2006年9月密 理博玛斯林(Multiscreen) HTS质粒96孔板用户指南(HTS PLASMID 96-ffellPlates User Guide)中所述的小规模制备程序加以纯化；以引用的方式并入本文中)。此方案详细地描 述于用户指南中。简单地说，玛斯林HTS质粒板位于歧管环的顶部。施加完全真空(24英寸 Hg) 5-7分钟或直到孔变空为止。200 μ L密凯(Milli-Q)级水或密理博溶液4加入玛斯林 HTS质粒板的每个孔中。施加完全真空3-5分钟或直到孔变空为止。为再悬浮质粒，50 μ L 密理博溶液5加入玛斯林HTS质粒板的每个孔中。为再悬浮DNA，在板式振荡器上振荡板5 分钟。为回收DNA，从玛斯林HTS质粒板的孔中吸移保留的质粒。为在无振荡下回收样品， 将再悬浮缓冲液加入孔中，且使板静置30分钟，接着吸移。
使用金思特(GeneScript)系统，通过离心来洗脱质粒DNA (例如，DNA已使 用0712007版金思特奎克林(QuickClean)96孔质粒小规模制备试剂盒手册(96ffell PlasmidMiniprep Kit Manual)中所述的小规模制备程序加以纯化；以引用的方式并入本 文中)。奎克林96孔质粒小规模制备试剂盒经设计，以通过离心来纯化每孔高达20 μ g高 纯度的质粒。质粒DNA结合至二氧化硅膜板上，洗涤所述膜，且用洗脱溶液(Tris缓冲液) 或水洗脱质粒DNA。所述方案详细地描述于小规模制备试剂盒手册中。简单地说，96孔结合 板位于所用1. 6ml 96深孔板的顶部且在2，500 Xg下离心5分钟，以结合膜上的质粒DNA。 弃去流过液。500 μ 1含乙醇的洗涤溶液加入96孔结合板中。板在2，500Xg下离心5分 钟，且弃去流过液。重复洗涤步骤。板在2，500Xg下再离心5分钟，以去除残留的洗涤溶液。96孔结合板位于96孔 收集板的顶部。将50 μ 1洗脱溶液转移至96孔结合板的孔中。使洗脱溶液在室温下培育 1-2分钟。板在2，500Xg下离心5分钟。重复洗脱。制备注射质量的核酸本发明涵盖以下认知，即集体式制备核酸(即制备大量核酸样品)以供注射至果 蝇属胚胎中的传统方法(例如上述方法)不产生“注射质量的核酸”。根据本发明，所有的核酸制备步骤都在室温下进行。一般说来，根据本发明，按照 以下程序获得DNA样品，且通过标准方法(例如通过测量OD26tl)测定浓度。约lml5X PB加 入深孔板的每个孔中，且约5倍体积的DNA (约15 μ g-约20 μ g) DNA加入PB中。将PB-DNA 溶液转移至96孔真空板(例如凯博96板)中。施加约IOOmb的真空。Iml PE缓冲液(含 有约80%乙醇)加入每个孔中进行洗涤。施加真空以抽出(drawthrough)大部分ΡΕ。重复 洗涤。将板转移至废液收集管中且在3200rpm (约16，000 X g)下离心2分钟。本发明涵盖以 下认知，即此离心步骤去除PE比单独真空有效得多。接着，在约IOOmb下威科波(vacuboy) 在板顶部辗过以消除过量的ΡΕ。干燥板至少20分钟(即直到所有可检测的乙醇痕迹都已 蒸发为止)。所述连续的干燥步骤不同于传统方案(例如凯杰)的干燥步骤。本发明涵盖以下认知，即增加干燥程度实质上会改进所制备核酸的质量。本发明涵盖以下认知，即离心从板的底部去除乙醇，且威科波从板的顶部去除乙醇。本发明涵盖以下认知，即空气干燥进 一步促进乙醇的去除且显著改进所制备核酸的质量。为洗脱DNA，按照以下程序将50 μ 1 IX注射缓冲液(0. ImM磷酸钠、5mM KCl ； PH彡8)加入每个孔中且使其静置1分钟。板在3200rpm(约16，OOOXg)下离心2分钟。 弃去流过液。将板转移至洁净的收集管中，且重复洗脱第二次和第三次。此步骤不同于传 统方案(例如凯杰)，传统方案仅利用一次洗脱。本发明涵盖以下认知，即多次洗脱允许使 用的洗脱体积显著小于传统方法(例如凯杰)所建议的最低洗脱体积。本发明涵盖以下认 知，即进行多次洗脱会改进所制备核酸的质量(例如DNA更纯净)。保留第二次和第三次洗 脱的流过液。本发明涵盖以下认知，即离心回收DNA比加真空至收集管中有效得多。通过 标准琼脂糖凝胶电泳来测定所制备核酸的质量和数量。同时处理多个所注射胚胎在鲁宾(Rubin)和斯布拉丁(Spradling)所描述的经典方案中，将所注射胚胎放 于保湿室中，且使之孵化，同时将孵化的幼体个别去除并转移至23°C下的标准蝇食物中。本发明尤其涵盖以下认知，即个别转移孵出的幼体为劳动密集型的且有伤害幼体 的危险。因此，本发明人研发出一种系统，其中胚胎可去除地附着于注射用衬底上，且所述 衬底接着转移至发生孵化的食物环境中。經在一些实施例中，P因子介导的转化方法可使用果蝇科(Drosophilidae family) 的任何属和/或种进行。在一些实施例中，P因子介导的转化方法可使用非果蝇科的科的 属和/或种进行。在一些实施例中，P因子介导的转化方法可使用双翅目(Diptera order) 的任何成员进行。本发明涵盖以下认知，即整合酶介导的转化方法可使用非果蝇科的科的 属和/或种进行。本发明涵盖以下认知，即整合酶介导的转化方法可使用双翅目的任何成 员进行。在一些实施例中，使用缺乏标记转化体的等位基因(例如ry5°6、W1118、yW、v、新霉素 抗性(neomycin resistance)、GFP和其它荧光蛋白质、IacZ等)的蝇来提供注射用胚胎。胚胎收集根据传统注射法，使用蝇瓶来收集注射用胚胎，这是通过将产卵板分接至已使用 20规格或更小的针戳出洞的塑料容器的底部来建立。根据多种传统方案，在收集开始前至 少2天，将瓶移到日夜交替的日程中，这是因为通常认为这样会增加所产的卵的数目。相比 之下，本发明的系统利用一种产卵系统，其中丙烯酸管(例如约2英寸至约4英寸长)在管 的一端包含网眼且在另一端包含葡萄板(grape plate)。也与传统方法形成对比，除了将旧 的葡萄板换成新鲜板时，产卵设备一直保持在恒定黑暗中。根据本发明，一般如下产生葡萄 板将22. 5g琼脂在750ml水中煮沸，当心不要沸溢。将1. 5g尼皮京(Nipigin)和25g蔗 糖在250ml 100%葡萄汁中煮沸，当心不要沸溢。两种混合物都冷却至约60°C并合并。将 所得混合物倾倒至皮氏板(Petri plate)中(每个板约10ml)。一般说来，记录胚胎收集的时间，以便在发生细胞化之前将DNA注射至每个胚胎 中。举例来说，在一些实施例中，使蝇产卵1/2小时，且接着收集卵和发育的胚胎。胚胎排 成行进行注射，耗时约1/2小时，且接着注射耗时约1/2小时。此计时使得卵在发生细胞化之前进行注射。根据传统注射方案，收集卵和胚胎后的所有步骤通常都在18°C下进行，以 减慢胚胎发育。根据传统注射法，减慢胚胎发育可确保卵在发生细胞化之前进行注射。与 传统方法形成对比，本发明的系统包含对于在收集卵和胚胎后的所有步骤，都保持胚胎在 200C -23°C下。利用本发明的系统，即使在这些温度下，所有卵也都可在发生细胞化之前进 行注射。制备沣射用胚胎一旦收集到胚胎，即可将其转移至粘着表面(例如显微镜载玻片上的双面胶带或 胶)上。可使用湿的蝇刷、钳和/或探针来转移胚胎。根据传统注射法，在注射之前去除卵壳。此举通常是为了防止针断裂和/或阻塞。 卵壳可通过在解剖显微镜下用钳轻轻打击胚胎来去除。或者或另外，可通过用漂白剂处理 来去除卵壳。举例来说，可用50%漂白剂/水溶液处理胚胎1-5分钟。可目视监测胚胎以 确定何时去除卵壳，且因此确定应何时停止在漂白溶液中培育。用漂白剂培育后，用水充分 清洗胚胎，以去除所有残留的漂白剂。相比之下，根据本发明系统，在注射之前不去除胚胎 卵壳。代之以仅将胚胎排成行，用油覆盖并注射。本发明涵盖意外的观测结果，即使卵壳保 持完整不会引起针断裂和/或阻塞。本发明涵盖意外的观测结果，即注射具有完整卵壳的 胚胎有助于维持胚胎的良好健康且可积极地影响存活率。在注射之前，将胚胎在粘着表面上排成行。一般说来，将胚胎在粘着表面(例如涂 有胶带或胶的显微镜盖玻片)上排成行，使其后端指向衬底边缘。通常，粘着表面可为任何 具有充分粘着性的表面，使得胚胎在注射过程期间保持附着于所述表面上。粘着表面通常 具有足以在注射后将胚胎输送至食物来源的刚度。在一些实施例中，其后端悬挂在粘着表 面的边缘。在一些实施例中，其后端未到达粘着表面的边缘。根据本发明系统，卵排成行， 使得其距离载玻片的边缘约1/2至约1个卵长度。在一些实施例中，使用双面胶带小球将 胚胎转移至粘着表面(例如双面胶带、胶等)上。在一些实施例中，使用蝇刷转移胚胎至粘 着表面上。一般说来，粘着剂对胚胎和/或从胚胎孵出的幼体无毒且不会负面干扰胚胎存 活。根据传统注射方案，在注射之前干燥排成行的胚胎。一般认为此举是确保注射成 功的重要步骤。具体说来，认为干燥是防止胚胎在注射后立即泄漏的必要条件。干燥方案 通常包含将附着胚胎的粘着表面放在含有燥石膏的盘中5-15分钟。相比之下，本发明的注 射法不包括干燥步骤。本发明涵盖以下意外认知，即胚胎无需通过干燥达到高存活率和/ 或转化率。本发明涵盖以下意外认知，即胚胎健康可通过省略干燥步骤得到改进。根据传统方法，干燥后，胚胎通常用卤代烃油(例如系列HC-700与系列27分别以 7 1比率达成的混合物)覆盖，且安放在连接至微量注射器的倒置显微镜的载物台上。相 比之下，本发明的注射法包含使用连接至微量注射器的立体显微镜。
注射设备根据传统方法，注射设备包含装备有20x透镜的倒置显微镜、微操作器和连接至 持针器的空气压力式注射装置(例如成茂(Narishige) IM-300微量注射器)。在一些传 统方法中，使用明视野或诺马斯基(Nomarski)显微术来监测注射。相比之下，本发明的注 射法利用立体显微镜(例如吉纳尔阀门公司(General Valve, Inc.)的皮克微量注射器 (Picospitzer))来监测注射。
根据传统方法，注射设备处于18°C空间中，这提供较大的时间灵活性，因为胚胎发 育较缓慢且用于注射的适当阶段持续较长时间。相比之下，本发明的系统包含将注射设备 安置在20°C-23°C空间中。本发明涵盖以下认知，即使是在这些温度下，所有卵也都可在其 发育超过用于注射的适当阶段之前进行注射。钍
在一些实施例中，针由硅化玻璃制成。在一些实施例中，针拉伸至小于约Ιμπι的 尖端直径。在一些实施例中，适用于胚胎注射的针包含约Imm毛细管。根据传统注射法，可在任何水平拉出器上拉伸针。举例来说，可使用具有Ω点纤 维(omega dot fiber)的1. Omm OD硼硅酸盐毛细管(例如费德里克 哈尔公司(Frederick Haer&Co),#30-30-0)在萨特(Sutter)牌系列的任何水平拉出器上拉伸针。每个机器的设 置不同，且通常每当替换加热长丝或使之再成形时或当使用新类型毛细管时都需要更新。 相比之下，根据本发明系统，使用垂直针拉出器拉伸针。具体说来，根据本发明系统利用卡 波夫(Kopf)仪器720型。一些参数影响针的形状和性质(例如热量、拉伸速度、气流压力、步骤数)。在一些 状况下，调节这些参数中的任一者对所得针的性质的影响可难以预测。米勒(Miller)等人 的论文(2002，生物技术(Biotechniques)，33 :366 ；以引用的方式并入本文中)描述一些 设计合适针的适用准则。在一些实施例中，用于注射胚胎的针应逐渐但短缓地变尖且没有 中断或梯级。一般说来，过度拉长的针在试图刺入胚胎时可能弯曲且断裂。过于短粗的针 一方面虽不易于弯曲，但可更严重地伤害胚胎且降低总存活率。一旦针适于平稳地刺入胚 胎，即可通过调整注射时间(例如IOms与40ms之间)和压力旋钮(P。ut和PbalanJ来调节 出来的注射混合物的量。针通常回填。可使用长的伸出的移液管尖端装载针，例如用以装载测序凝胶的移 液管尖端。在大部分状况下，针装载有几微升注射质量的核酸。一旦注射质量的核酸已装 载至针中，即可将针安装至注射设备中。根据传统方法，一旦针已负荷核酸，即在注射第一个胚胎之前将针的尖端打破以 在尖端中产生开口。许多技术可用于打破针的尖端。在一些实施例中，针的尖端可通过使 尖端穿过卤代烃油刺入粘着表面上的双面胶带层中来打破。或者，针的尖端可通过使用磨 粉浆料和规则的磁力搅拌装置斜削尖端来打破。浆料由1 3比率的碳化硅粉和CldH2O制 成。应将粗砂洗涤若干次以去除在主体沉积后仍可悬浮的小粒子。当搅拌浆料时，移液管 的尖端以相对于浆料流动方向呈135°的角度插入。通过保持针的平稳状态达4-5分钟，使 针的尖端斜削成尖点。在一些实施例中，针的尖端可通过在显微镜下使针的尖端平缓地接 触载玻片的边缘同时施加轻微正压力来打破。相比之下，根据本发明系统，在注射第一个胚 胎之前不打破针。根据本发明系统，在注射第一个胚胎之后随即打破针。注射胚胎在注射至胚胎中之前，从针中排出空气，直到核酸溶液开始流入覆盖胚胎的油中 为止。通常，通过刺入胚胎的后端，尽可能地抽出针背但使其仍在胚胎内，并将注射质量的 核酸溶液挤入胚胎中，来注射胚胎。根据传统方法，应将胚胎体积的约1%、约2%、约3%、 约4%、约5%或约5%以上挤入每个胚胎中。相比之下，根据本发明系统，将约对应于胚胎 直径的约1/4至约1/2的体积挤入每个胚胎中。
在注射单轮中的所有胚胎后，可去除损伤和/或不适当老化的胚胎。注射后，将胚胎放在湿培养基上且使之孵化。举例来说，在一些实施例中，胚胎转移至食物来源中。在一些实施例中，胚胎转移至已涂有酵母(即酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae))溶液条纹的苹果汁或葡萄汁板上。根据传统方法，从粘着表 面个别地去除胚胎，且直接放在食物来源上。相比之下，根据本发明系统，附着胚胎的整个 粘着表面都放在食物来源上。幼体在孵化后能够爬行至食物处，且使存活者生长至成年期。蝇杂交黑腹果蝇发育的速率很大程度上依赖于环境温度。在25°C下，受精后约1天，胚胎 已完全发育且孵化成幼体。幼体不断地进食且生长，在孵化后1天、2天和4天蜕皮(分别 是初龄、二龄和三龄)。2天后，作为三龄幼体，其再一次蜕皮，从而形成不能移动的蛹。在 接下来4天期间，躯壳经历变态作用，形成成年翼形，接着从蛹壳中孵出(即“羽化”)。在 18°C下发育耗时是25°C下约2倍。鉴别和定位转化体通常，对于P因子介导的转化，注射过程后存活的胚胎与注射原种(stock)个别回 交。对于cpC31整合酶介导的转化，存活的胚胎与携带突变的蝇(例如W118)个别回交。进行 此步骤是因为不是每次都插入种系细胞中，而一些是插入体细胞中。通过异型杂交选择插 入种系且能够将外源性核酸传给其子代的细胞系。与注射原种回交常常进行两次以确保选 择稳定的种系转化体。在一些实施例中，注射后，每个FO雌蝇都与亲本品系的至少两个雄蝇杂交，而每 个雄蝇都与亲本品系的至少两个处女雌蝇杂交。在这些单次配对的子代中筛选转化体。给 出仅一个实例，考虑以下状况，其中表达使色素在眼睛中表达的基因的外源性核酸注射至 白眼原种(例如W1118)中1)单次杂交中没有眼睛中显示色素的Fl个体。此通常表明没有转化体。2) 一些Fl个体(例如小于10%)的眼睛中显示色素。如果每个雌蝇都显示比有 颜色的雄蝇浅的相同眼睛颜色，那么很可能此管将产生单个转基因品系。3)多个Fl个体(50%以上)显示多种眼睛颜色。此常常指示多个插入物。视情 况而定，应选择显示眼睛颜色较浅的个体用于进一步杂交。在一些实施例中，不需要多个插 入物。在一些实施例中，可弃去显示眼睛颜色较浓的个别蝇，因为其常常具有多个插入物。Fl个体在X染色体、染色体II或染色体III中的任一者上都可具有一个或一个 以上转基因插入物。插入染色体IV上的转基因非常稀少，这是因为此染色体相当小且基本 上为多色的。在一些实施例中，转基因以小于约5%的比率整合在染色体IV上。在一些实 施例中，转基因以约的比率整合在染色体IV上。在一些实施例中，Fl蝇与平衡原种杂 交。在一些实施例中，Fl蝇与W118蝇杂交。在一些实施例中，单个雄性Fl转化体与平衡原 种或W118原种杂交。在一些实施例中，单个雌性Fl转化体与平衡原种或W118原种杂交。一 般说来，建立单个杂交可降低多个插入物的可能性。一旦鉴别出似乎转基因的细胞系，即通常使含有此转基因的原种与平衡原种杂交 以避免因减数分裂期间的重组事件而损失此转基因。有效处女蝇收集雌蝇可储存充足精子供卵用一生，因此当建立杂交时，必须使用处女雌蝇。为收集处女蝇，雌蝇在达到性成熟之前必须与雄蝇隔离。雌蝇在25°C下保持为处女蝇达约6小时 至8小时，且在18°C下保持为处女蝇达16小时至18小时。在一些实施例中，可通过使用 一天两次的程序来收集处女蝇，其中在早晨清洁小瓶/瓶，放于25°C下约6小时，收集雌蝇 (应都是处女蝇)，且将小瓶/瓶放在18°C下过夜，且下一个早晨再次收集雌蝇/处女蝇。如 果错过收集，或只需要几个处女蝇进行特定杂交，那么可通过腹部存在黑斑来鉴别处女蝇。为收集处女雌蝇，在25°C下通常每6-8小时检查蝇的小瓶，且将雌蝇与雄蝇分离 开。在18°C下通常每10小时-12小时检查蝇的小瓶，且将雌蝇与雄蝇分离开。 在一些状况下，可通过目视检查蛹来分离雌蝇。可鉴别显示雌性身体特征而非雄 性身体特征的蝇，且在羽化之前放于单独的食物小瓶中。因此，在此食物小瓶中羽化的仅有 的蝇是雌蝇且因此为处女蝇。在一些实施例中，“处女”原种可用于简化收集处女蝇的过程。处女原种通常为 仅有雌蝇存活至成年期的蝇原种。一般说来，任何携带当在诱导性启动子控制下在Y染色 体上表达时致死的转基因的原种都是本发明的处女原种。举例来说，hS-hid处女原种的 特征在于Y染色体上存在热休克(heat-shock，hs)hid构建体。当幼体经受热休克(例如 37°C )时，hid在雄蝇中过度表达，从而致死。给出另一个实例，另一处女原种在雄蝇X染 色体上携带对温度敏感的致死突变shibire-ts (Shits)(霍尔(Hall，L)，1973，果蝇属信息 服务(Drosophila Inform. Serv.)，50 103 ；以引用的方式并入本文中)。当在蛹期期间在 30°C下生长时，Shits雄蝇死亡，留下仅有雌蝇孵化的瓶。表2中呈现一些例示性处女原种。表2.例示性处女原种 应用本发明的系统和方法可用于将任何外源性核酸引入任何果蝇属物种中。在一些实 施例中，本发明的系统和方法可用于将任何外源性核酸引入双翅目的任何成员中。在一些 实施例中，本发明方法可用于驱动果蝇属中的一个或一个以上异源核酸(例如编码蛋白质 的基因)表达。在一些实施例中，异源核酸序列是存在于果蝇属基因组中的核酸序列。在 一些实施例中，异源核酸序列是不存在于果蝇属基因组中的核酸序列。
在一些实施例中，可使用组成性启动子驱动表达。举例来说，可制备包含通过翻译融合异源核酸序列(例如编码蛋白质的基因)的组成性启动子(例如肌动蛋白启动子)的 核酸构建体。为达成此实例的目的，此类构建体将称为“act-GeneX”。act-GeneX转基因的 蝇由组成性act启动子驱动表达GeneX。在一些实施例中，可使用条件性启动子驱动表达。条件性启动子允许空间和/或 时间上控制转基因的表达。举例来说，可制备包含通过翻译融合异源核酸序列(例如编码 蛋白质的基因)的Gal4识别序列(例如上游活化序列或“UAS”)的核酸构建体。为达成 此实例的目的，此类构建体将称为“UAS-GeneX”。当UAS-GeneX转基因的蝇的品系与表达 Gal4的蝇杂交时，在UAS控制下的GeneX在杂交子代中表达。在一些实施例中，本发明方法可用于在果蝇属中表达经标记的构建体。给出仅一 个实例，核酸构建体可包含如上所述在组成性或条件性启动子的控制下经亲和标签(例如 6x His标签、FLAG标签、GST标签等)标记的编码蛋白质的基因。在一些实施例中，亲和标 签在基因序列的5'上。在一些实施例中，亲和标签在基因序列的3'上。在一些实施例中， 亲和标签在基因序列的中间。在一些实施例中，亲和标签允许有效地纯化所表达的基因产 物。在一些实施例中，亲和标签允许目测所表达的基因产物(例如通过免疫组织化学使用 识别此亲和标签的抗体)。在一些实施例中，本发明方法可用于在果蝇属中诱发突变。举例来说，可引入转基 因，其驱动通常存在于果蝇属中，但携带一个或一个以上突变的基因表达。在一些实施例中，本发明方法可用于插入诱变。在一些状况下，核酸(例如P因 子)整合至基因组中破坏基因表达的位置中。如果核酸整合至编码序列中或基因的调节序 列中，那么这种情况有可能发生。在一些实施例中，本发明方法可用于发展果蝇属模型用于人类疾病。举例来说，可 产生蝇模型，且接着可进行小分子药物的筛选，或可进行表型修饰基因的遗传筛选。在一些实施例中，本发明方法可用于研究人类疾病。尽管果蝇属与人类之间存 在复杂性差异，但是基因组学分析已经证实许多涉及所控制的大量过程和功能机制的关 键蛋白质非常类似。实际上，果蝇属物种具有所有人类基因的约60%。基于这些相似性， 果蝇属已展示用作研究人类疾病的模型系统。在一些实施例中，用于人类疾病的果蝇属 模型可含有一个或一个以上已知与人类疾病相关联的蝇基因中的一个或一个以上突变。 在一些实施例中，用于人类疾病的果蝇属模型可含有一个或一个以上突变，使得蝇中产生 的表型类似于与人类疾病相关联的表型。目前已知一些果蝇属模型有效用于人类疾病， 这些疾病的实例包括(但不限于)PolyQ病，例如SCAl (表达艾塔辛(ataxin) 1的致病 形式)、MJD/SCA3(表达艾塔辛3的致病形式)、肯尼迪氏病(Kennedy' s Disease)(雄 激素受体突变)和亨廷顿氏病(Huntington' s Disease)(影响poly Q病理；突变影响 亨廷顿蛋白质)；脊髓性肌萎缩(由人类动动神经元存活I(SMNl)基因突变引起)；阿尔 茨海默氏病(Alzheimer' s Disease)(表达人类蛋白质τ、β淀粉状蛋白和/或早老 素(presenillin)的神经退化性疾病相关形式)；帕金森氏症(Parkinson' s Disease) (α -突触核蛋白基因突变，例如Α53Τ和/或Α30Ρ突变)；肥胖症(例如脂肪基因突变 引起肥胖蝇)；糖尿病(影响胰岛素通路的突变)；肌萎缩性侧索硬化(葛雷克氏症(Lou Gehrig' sDisease)；铜/锌超氧化物歧化酶突变体)；和癫痫(K+通道基因突变)。
在一些实施例中，果蝇属疾病模型可适用于筛选治疗疾病的治疗剂。举例来说，果 蝇属模型可适用于筛选小分子药物文库以鉴别在人类中可为治疗上有效的物质。在一些实施例中，果蝇属模型可用作进行遗传筛选的遗传背景。通过监测疾病表 型，筛选可鉴别蝇中与所述疾病表型有关的基因。举例来说，此类筛选可鉴别疾病表型的增 强因子和/或抑制因子。一旦鉴别出，即可分析这些基因在人类疾病中的作用。范例 实例1 同时制备96个注射质量的核酸样品所有步骤都在室温下进行。获得DNA样品，且通过标准方法(例如通过测量OD26tl) 测定浓度。约Iml 5X PB (含有异丙醇和盐酸胍)加入深孔板的每个孔中，且约5倍体积的 DNA (约15 μ g-约20 μ g) DNA加入PB中。将PB-DNA溶液转移至96孔真空板(例如凯博 96板)中。施加约IOOmb的真空。Iml PE缓冲液(含有约80%乙醇)加入每个孔中进行 洗涤。施加真空以抽出大部分PE。重复洗涤。将板转移至废液收集管中且在3200rpm(约 16, 000 Xg)下离心2分钟。本发明涵盖以下认知，即此离心步骤去除PE比单独真空有效得 多。接着，在约IOOmb下威科波在板顶部辗过以消除过量的PE。干燥板至少20分钟(即直 到所有可检测量的乙醇都已蒸发为止)。为进行洗脱，将50 μ 1 IX注射缓冲液(0. ImM磷酸钠、5mM KCl ；pH彡8)加入每个 孔中且使其静置1分钟。板在3200rpm(约16，000Xg)下离心2分钟。弃去流过液。将板 转移至洁净的收集管中，且重复洗脱第二次和第三次。保留第二次和第三次洗脱的流过液。 本发明涵盖以下认知，即离心回收DNA比加真空至收集管中有效得多。通过标准琼脂糖凝 胶电泳来验证所纯化的DNA的质量和数量。实例2:注射胚胎微量离心管在离心机中以13，200rpm(约16，OOOXg)离心2分钟。使用微量上 样器将0.5μ1 DNA负荷至硼硅酸盐毛细管拉伸的针中。将一片3mmX 1.5cm的斯高奇 (Scotch)⑧可更换海报胶带(Removable Poster Tape)(产品号是109)连接至标准玻璃显 微镜载玻片。在琼脂_葡萄板上产卵，持续30分钟。在随后30分钟内将卵转移至双面胶带 上，使卵间的间隔为0.5mm。确定卵的方向，使其后端指向载玻片的一个边缘。用卤代烃油 覆盖卵。使用包含蔡司(Zeiss)立体显微镜、吉纳尔阀门皮克微量注射器III注射器和成 茂MN-153微操作器的注射装置，用所负荷的DNA注射卵。使用的DNA液滴是卵宽度的0. 2 倍-0. 33倍。使用尖锐的刀片，将具有所注射的卵的双面胶带从载玻片上剥离，并放入蝇食 物小瓶中，使卵朝上。实例3 有效收集处女蝇在一些实施例中，使用hs-hid处女原种收集处女雌蝇。使来自hs-hid原种的蝇 在25°C下交配3天。在第3天结束时，将成年蝇倒出小瓶。在第4天，对具有幼体的小瓶 进行热休克(例如在37°C水浴中培育2小时)。2小时后，使小瓶返回25°C恒温箱。在第 5天，重复热休克。在25°C下培育蝇，直到处女雌蝇开始羽化为止(例如约一周)。收集成 年处女蝇。实例4 有效产生转基因果蝇属的快速多重过程包含约50个不同的DNA制剂的96孔板用于胚胎注射。每个DNA制剂都包含使用 cpC31整合酶技术的注射用构建体、和捷威 载体(英杰公司(Irwitrogemlnc.)，加利福尼亚州(CA)卡尔斯巴德(Carlsbad))。每个注射构建体的大小都为约12kb。在约10小时内每个构建体注射约50-约100个胚胎。注射后，约50%所注射胚胎存活至成年期。其中，约85%为可育的且约72%为转 化体。等效物和范围仅使用常规实验，所属领域的技术人员将识别或能够确定本文所述的本发明具体 实施例的多个等效物。本发明的范围不欲限于以上描述，而是如随附权利要求书中所阐述。仅使用常规实验，所属领域的技术人员将识别或能够确定本文所述的本发明具体 实施例的多个等效物。本发明的范围不欲限于以上描述，而是如随附权利要求书中所阐述。在权利要求书中，除非相反指示或从上下文其它方面显而易见，否则例如“一种 (a、an)，，和“所述”等词可意指一种或一种以上。因此，举例来说，对“一个纳米粒子”的提 及包括多个所述纳米粒子，且对“所述细胞”的提及包括对所属领域的技术人员已知的一种 或一种以上细胞的提及等等。除非相反指示或从上下文其它方面显而易见，否则如果一个、 一个以上或全部的群组成员存在于、用于所给出的产物或过程中或以其它方式与所给出的 产物或过程有关，那么认为符合一个或一个以上群组成员之间包括“或”的权利要求或描 述。本发明包括正好一个群组成员存在于、用于所给出的产物或过程中或以其它方式与所 给出的产物或过程有关的实施例。本发明包括一个以上或全部的群组成员存在于、用于所 给出的产物或过程中或以其它方式与所给出的产物或过程有关的实施例。此外，应了解本 发明涵盖一个或一个以上限制、要素、从句、描述性术语等从一项或一项以上所列权利要求 引入另一项权利要求中的所有变化、组合和变换。举例来说，任何依赖于另一项权利要求的 权利要求都可进行修改，以包括一个或一个以上在任何其它依赖于同一基础权利要求的权 利要求中发现的限制。此外，在权利要求叙述一种组合物的情况下，除非另外指示或除非所 属领域的技术人员清楚会产生矛盾或不一致，否则应了解包括使用该组合物的方法以达成 本文所揭示的任何目的，且包括根据本文所揭示的任何制造方法或所述领域中已知的其它 方法制造所述组合物的方法。在例如以马库什群组格式(Markush group format)将要素呈现为清单的情况下， 应了解也揭示所述要素的每个子群且任何要素都可从所述群组中去除。应了解，一般说来， 在提及本发明或本发明的方面包含特定要素、特征等的情况下，某些本发明实施例或本发 明方面由这些要素、特征等组成，或基本上由这些要素、特征等组成。为简单起见，本文中未 以这些词语(in haec verba)明确阐述这些实施例。应注意，术语“包含”意欲为开放性的 且允许包括其它要素或步骤。在给出范围的情况下，包括端点。此外，应了解，除非另外指示或从上下文和所属 领域的技术人员所理解的其它方面显而易见，否则表示为范围的值在不同的本发明实施例 中可采用所述范围内的任何具体值或子范围，除非上下文另外清楚规定，否则达到此范围 下限的个位数的十分之一的程度。另外，应了解，先前技术内的任何特定的本发明实施例都可明确地排除在任一项 或一项以上权利要求之外。因为认为这些实施例为所属领域的技术人员已知，所以即使本 文中未明确阐述排除在外，也可将其排除在外。本发明组合物的任何特定实施例(例如注 射质量的核酸的任何特征、制备注射质量的核酸的任何方法、注射胚胎的任何方法、任何果蝇属物种、任何治疗应用等)都可因任一原因而排除在任一项或一项以上权利要求之外， 而不管是否与先前技术的存在相关。 以上所讨论且贯穿正文的出版物只在本申请案的申请日期之前提供其揭示内容。 本文中不应认为承认本发明人无权先于根据先前揭示内容的所述揭示内容。
权利要求
一种方法，其包含以下步骤获得多个不同的核酸样品以供注射至果蝇属(Drosophila)胚胎中；和每分钟注射至少8个胚胎，使得至少30％所注射胚胎存活。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少5个不同的核酸样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少10个不同的核酸样Pm o
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少25个不同的核酸样Pm o
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少50个不同的核酸样Pm o
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少100个不同的核酸样Pm o
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少250个不同的核酸样Pm o
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少500个不同的核酸样Pm o
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少1000个不同的核酸样Pm o
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个内的个别核酸样品含有相同的核酸构建体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个内的每个核酸样品含有不同的核酸构建体。
12.根据权利要求1所述的方法，其中约40%所注射胚胎存活至成年期。
13.根据权利要求1所述的方法，其中约50%所注射胚胎存活至成年期。
14.根据权利要求1所述的方法，其中约60%所注射胚胎存活至成年期。
15.根据权利要求1所述的方法，其中约70%所注射胚胎存活至成年期。
16.根据权利要求1所述的方法，其中约80%所注射胚胎存活至成年期。
17.根据权利要求1所述的方法，其中约90%所注射胚胎存活至成年期。
18.根据权利要求1所述的方法，其中约100%所注射胚胎存活至成年期。
19.根据权利要求1所述的方法，其中至少30%所注射胚胎变成可育成体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中约40%所注射胚胎变成可育成体。
21.根据权利要求19所述的方法，其中约50%所注射胚胎变成可育成体。
22.根据权利要求19所述的方法，其中约60%所注射胚胎变成可育成体。
23.根据权利要求19所述的方法，其中约70%所注射胚胎变成可育成体。
24.根据权利要求19所述的方法，其中约80%所注射胚胎变成可育成体。
25.根据权利要求19所述的方法，其中约90%所注射胚胎变成可育成体。
26.根据权利要求19所述的方法，其中约100%所注射胚胎变成可育成体。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述注射步骤包含 穿过完整的卵壳注射。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述注射步骤包含 注射至未干燥的胚胎中。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤另外包含纯化所述核酸样品。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述纯化步骤包含 使所述核酸样品结合至过滤器；用洗涤缓冲液洗涤所述过滤器； 施加真空至所述过滤器的底部； 将所述过滤器离心；和 施加真空至所述过滤器的顶部；和 使所述过滤器空气干燥。
31.根据权利要求30所述的方法，其另外包含用洗脱缓冲液从所述过滤器洗脱所述核 酸样品的步骤。
32.根据权利要求31所述的方法，其另外包含重复所述洗脱步骤至少一次的步骤。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约40yl与约80 yl之间 的洗脱缓冲液进行。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约40yl的洗脱缓冲液进行。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约50yl的洗脱缓冲液进行。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约60yl的洗脱缓冲液进行。
37.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约70yl的洗脱缓冲液进行。
38.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约80u 1的洗脱缓冲液进行。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约20°C与约23°C之间范围内的温 度下进行。
40.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约20°C的温度下进行。
41.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约21°c的温度下进行。
42.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约22°C的温度下进行。
43.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约23°C的温度下进行。
44.根据权利要求1所述的方法，其中所述注射步骤包含射入对应于胚胎直径的1/4与 1/2之间的体积的核酸制剂。
45.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约8个胚胎。
46.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约10个胚胎。
47.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约12个胚胎。
48.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约15个胚胎。
49.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约20个胚胎。
50.根据权利要求1所述的方法，其中每个核酸样品都包含至少一个能够进行P因子介导的转化的构建体。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约10kb至约50kb。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约10kb。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约20kb。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约30kb。
55.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约40kb。
56.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约45kb。
57.根据权利要求50所述的方法，其中每个核酸制剂都另外包含驱动转座酶表达的构 建体。
58.根据权利要求1所述的方法，其中每个核酸制剂都包含能够进行整合酶介导的转 化的构建体。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约10kb至约150kb。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约10kb。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约25kb。
62.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约50kb。
63.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约75kb。
64.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约lOOkb。
65.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约125kb。
66.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约150kb。
67.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体包含至少一个attB位点。
68.根据权利要求58所述的方法，其中每个核酸制剂都另外包含驱动整合酶表达的构 建体。
69.一种方法，其包含以下步骤获得核酸制剂以供多次注射至果蝇属胚胎中；使所述制剂经受纯化，其包含以下步骤使所述制剂结合至过滤器；用洗涤缓冲液洗涤所述过滤器；施加真空至所述过滤器的底部；将所述过滤器离心；和施加真空至所述过滤器的顶部；和使所述过滤器空气干燥；用洗脱缓冲液从所述过滤器洗脱所述制剂；和重复所述洗脱步骤至少一次。
70.一种方法，其包含以下步骤获得多个核酸制剂以供注射多个构建体至果蝇属胚胎中； 使所述多个核酸制剂经受纯化，其包含以下步骤 使每个核酸制剂结合至过滤器； 用洗涤缓冲液洗涤每个过滤器； 施加真空至每个过滤器的底部；将每个过滤器离心；和 施加真空至每个过滤器的顶部；和 使所述过滤器空气干燥；用洗脱缓冲液从所述过滤器洗脱所述多个核酸制剂；和 重复所述洗脱步骤至少一次。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂提供在96孔板上。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少5个不同的核酸制剂。
73.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少10个不同的核酸制剂。
74.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少25个不同的核酸制剂。
75.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少50个不同的核酸制剂。
76.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少100个不同的核酸 制剂。
77.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少250个不同的核酸 制剂。
78.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少500个不同的核酸 制剂。
79.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少1000个不同的核酸 制剂。
80.根据权利要求70所述的方法，其中每个核酸制剂都包含至少一个能够进行P因子 介导的转化的构建体。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述构建体为约10kb至约50kb。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述构建体为约10kb。
83.根据权利要求80所述的方法，其中所述构建体为约20kb。
84.根据权利要求80所述的方法，其中所述构建体为约30kb。
85.根据权利要求80所述的方法，其中所述构建体为约40kb。
86.根据权利要求80所述的方法，其中所述构建体为约45kb。
87.根据权利要求80所述的方法，其中每个核酸制剂都另外包含驱动转座酶表达的构 建体。
88.根据权利要求70所述的方法，其中每个核酸制剂都包含能够进行整合酶介导的转 化的构建体。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述构建体为约10kb至150kb。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述构建体为约10kb。
91.根据权利要求88所述的方法，其中所述构建体为约25kb。
92.根据权利要求88所述的方法，其中所述构建体为约50kb。
93.根据权利要求88所述的方法，其中所述构建体为约75kb。
94.根据权利要求88所述的方法，其中所述构建体为约lOOkb。
95.根据权利要求88所述的方法，其中所述构建体为约125kb。
96.根据权利要求88所述的方法，其中所述构建体为约150kb。
97.根据权利要求88所述的方法，其中所述构建体包含至少一个attB位点。
98.根据权利要求88所述的方法，其中每个核酸制剂都另外包含驱动整合酶表达的构 建体。
99.根据权利要求70所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约40yl与约80 yl之间 的洗脱缓冲液进行。
100.根据权利要求70所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约40iil的洗脱缓冲液进行。
101.根据权利要求70所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约50iil的洗脱缓冲液进行。
102.根据权利要求70所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约60yl的洗脱缓冲液进行。
103.根据权利要求70所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约70yl的洗脱缓冲液进行。
104.根据权利要求70所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约80yl的洗脱缓冲液进行。
105.一种方法，其包含以下步骤 提供一群蝇；收集此群蝇所产的卵； 使所述卵发育成胚胎； 将所述胚胎以相同取向沿直线排成行； 用核酸制剂注射每个胚胎； 使每个胚胎孵化。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述注射步骤包含 穿过完整的卵壳注射。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述注射步骤包含 注射至未干燥的胚胎中。
108.根据权利要求105所述的方法，其中所有步骤都在20°C与23°C之间范围内的温度 下进行。
109.根据权利要求105所述的方法，其中所有步骤都在约20°C的温度下进行。
110.根据权利要求105所述的方法，其中所有步骤都在约21°C的温度下进行。
111.根据权利要求105所述的方法，其中所有步骤都在约22°C的温度下进行。
112.根据权利要求105所述的方法，其中所有步骤都在约23°C的温度下进行。
113.根据权利要求105所述的方法，其中所述收集卵的步骤利用包含以下的产卵系统丙烯酸管，其中所述丙烯酸管为约2英寸至约4英寸长，其中所述丙烯酸管在所述管的 一端包含网眼且其中所述丙烯酸管在所述管的另一端包含葡萄板。
114.根据权利要求113所述的方法，其中除了将旧的葡萄板换成新鲜葡萄板时，所述 产卵设备都维持在恒定黑暗中。
115.根据权利要求105所述的方法，其中所述注射步骤包含射入对应于胚胎直径的 1/4与1/2之间的体积的核酸制剂。
116.根据权利要求105所述的方法，其中所述核酸制剂包含能够进行P因子介导的转 化的构建体。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述构建体为约10kb至约50kb。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述构建体为约10kb。
119.根据权利要求117所述的方法，其中所述构建体为约20kb。
120.根据权利要求117所述的方法，其中所述构建体为约30kb。
121.根据权利要求117所述的方法，其中所述构建体为约40kb。
122.根据权利要求117所述的方法，其中所述构建体为约45kb。
123.根据权利要求117所述的方法，其中每个核酸制剂都另外包含驱动转座酶表达的 构建体。
124.根据权利要求123所述的方法，其中每个核酸制剂都包含能够进行整合酶介导的 转化的构建体。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述构建体为约10kb至约150kb。
126.根据权利要求124所述的方法，其中所述构建体为约10kb。
127.根据权利要求124所述的方法，其中所述构建体为约25kb。
128.根据权利要求124所述的方法，其中所述构建体为约50kb。
129.根据权利要求124所述的方法，其中所述构建体为约75kb。
130.根据权利要求124所述的方法，其中所述构建体为约lOOkb。
131.根据权利要求124所述的方法，其中所述构建体为约125kb。
132.根据权利要求124所述的方法，其中所述构建体为约150kb。
133.根据权利要求124所述的方法，其中所述构建体包含至少一个attB位点。
134.根据权利要求105所述的方法，其中每分钟注射至少8个胚胎。
135.根据权利要求105所述的方法，其中每分钟注射约8个胚胎。
136.根据权利要求105所述的方法，其中每分钟注射约10个胚胎。
137.根据权利要求105所述的方法，其中每分钟注射约12个胚胎。
138.根据权利要求105所述的方法，其中每分钟注射约15个胚胎。
139.根据权利要求105所述的方法，其中每分钟注射约20个胚胎。
140.根据权利要求105所述的方法，其中至少30%所注射胚胎存活至成年期。
141.根据权利要求105所述的方法，其中约30%所注射胚胎存活至成年期。
142.根据权利要求105所述的方法，其中约40%所注射胚胎存活至成年期。
143.根据权利要求105所述的方法，其中约50%所注射胚胎存活至成年期。
144.根据权利要求105所述的方法，其中50%与100%之间的所注射胚胎存活至成年期。
145.根据权利要求105所述的方法，其中至少30%所注射胚胎存活且变成可育成体。
146.根据权利要求105所述的方法，其中约30%所注射胚胎存活且变成可育成体。
147.根据权利要求105所述的方法，其中约40%所注射胚胎存活且变成可育成体。
148.根据权利要求105所述的方法，其中约50%所注射胚胎存活且变成可育成体。
149.根据权利要求105所述的方法，其中50%与70%之间的所注射胚胎存活且变成可 育成体。
150.根据权利要求105所述的方法，其中所述将所述胚胎排成行的步骤包含在衬底上将所述胚胎排成行，其中所述胚胎附 着于所述衬底上；且其中在所述注射每个胚胎的步骤之后且在所述使每个胚胎孵化的步骤之前，将所述衬 底转移至蝇食物培养基中，使得所述多个胚胎同时转移。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述衬底为胶。
152.根据权利要求150所述的方法，其中所述衬底为双面胶带。
153.根据权利要求150所述的方法，其另外包含以下步骤 用卤代烃油覆盖所述多个胚胎。
154.根据权利要求150所述的方法，其另外包含以下步骤 将所述多个胚胎维持在使至少一些胚胎孵化的条件下。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述多个胚胎维持在16°C与29°C之间范围内 的温度下。
156.根据权利要求154所述的方法，其中所述多个胚胎维持在约16°C的温度下。
157.根据权利要求154所述的方法，其中所述多个胚胎维持在约18°C的温度下。
158.根据权利要求154所述的方法，其中所述多个胚胎维持在约20°C的温度下。
159.根据权利要求154所述的方法，其中所述多个胚胎维持在约22°C的温度下。
160.根据权利要求154所述的方法，其中所述多个胚胎维持在约24°C的温度下。
161.根据权利要求154所述的方法，其中所述多个胚胎维持在约26°C的温度下。
162.根据权利要求154所述的方法，其中所述多个胚胎维持在约28°C的温度下。
163.根据权利要求105所述的方法，其中所述胚胎在X染色体上携带诱导性雄性致死 突变。
164.根据权利要求163所述的方法，其另外包含使从胚胎孵化的幼体经受驱动诱导性 启动子表达的条件的步骤，使得所有孵出的雄蝇都死亡且雌蝇都保持为处女蝇。
全文摘要
本发明提供允许可靠地多重转化果蝇属(Drosophila)胚胎的系统。本发明提供允许制备注射质量的核酸样品并允许同时制备多个所述样品的方法和试剂。本发明提供同时处理多个所注射胚胎的系统。本发明提供转化果蝇属胚胎的方法，所述方法包含使用处女品系(virginator strain)，这些品系可用于增加建立产生注射用卵所需的杂交和筛选转化体所需的杂交的效率。
文档编号A01K67/033GK101873795SQ200880116308
公开日2010年10月27日 申请日期2008年11月20日 优先权日2007年11月20日
发明者苏珊·B·祖斯曼, 迈克尔·特罗杰 申请人:遗传服务公司