专利名称：：合欢荚果提取物及其制备方法与抗菌剂的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及合欢荚果提取物及其制备方法与抗菌剂。
背景技术：
：天然药物来自植物、动物、矿物，并以植物来源为主。在现代技术进展，特别是化合物分离和结构鉴定取得突破性进展下，由于组合化学合成时代不适合高通量合成需要而研究一度下降的天然产物研究[匿KNFE，CARTERGT.Theevolvingroleofnaturalproductsindrugdiscovery[J].NatureReviewsDrugDiscovery,2005，4:206-220.]以及只追求数量而忽略质量的有机合成时代的过去[(XARDYJ，WALSHC.Lessonsfromnaturalmolecules[J].Nature,2004，432:829-837]，再加上病原菌抗药性的严重威胁，植物源杀菌剂具有不污染环境，对人畜安全，害虫不易产生抗性等特点，使得天然产物又成为作为发现新药物的重要来源和从植物中寻找新型的具有杀菌活性的天然化合物的研究又重新获得普遍的关注[PATERSONI，ANDERSONEA.Therenaissanceofnaturalproductsasdrugcandidates[J].Science,2005,310:451-453;KoeknFE，CarterGT.Theevolvingroleofnaturalproductsindrugdiscovery[J],NatureReviewsDrugDiscovery,2005，4:206-220;张慧，《余大高，潘汝谦，徐汉虹一些植物提取物的抗菌活性筛选[J]植物病理学报，2008,38(4):441-444]。植物的次生代谢产物(secondarymetabo-lismsubstance)中的很多种成分，如生物碱、蒽醌、黄酮、皂苷、挥发油、有机酸、鞣质等是重要的药物来源。在基础科学研究中由于天然产物具有化学结构的多样性以及作用机理的多样性、在应用研究中，例如在农业领域由于食品的安全性及农业无公害、绿色、有机生产以及农产品出口贸易跨越"绿色技术壁垒"的迫切需要，使得从天然植物或其他天然物中发现、并研究来自天然产物的抗菌、抗病虫害药及其提取的最佳方法，又成为当今研究和开发的趋势。我国植物资源丰富，在植物中寻找抗菌、抗氧化和其他活性成分一直是资源植物化学及天然产物化学研究的主流[方颖，温明章.我国资源植物化学与天然产物化学基础研究的现状与发展[J].生命科学，2005，17(3):282-285.]。合欢属J/Z^z/"系豆科含羞草亚科植物，约100多种，广泛分布于世界各地。我国有17种，大部分产于江苏、江西、福建、浙江和西南部各省，是美化环境，净化空气和药用价值的优良树种。其中最常见的有合欢J/^z/力M/^^/"Durazz.。《中国药物大辞典》中指出"小叶两列，日暮相叠如睡，及朝，又渐分离，故有合欢"。合欢皮和花为较常用的中药，有治心神不安、忧郁失眠作用；外用治疗骨折、痈胸疬；其叶具有吸收空气中硫氧化物的作用。对合欢皮的化学研究表明，合欢皮中含有三萜、黄酮、木脂素、生物碱、鞣质及多糖等多种化学成分[宋立人.现代中药学大辞典.北京人民卫生出版社，2001.876;陈四平，张如意.合欢皮中三萜皂苷元的研究.药学学报，1997，32(2):144-146;JuneiKinjo,KaoruAraki,KatsuraFukui,etal.SixnewtriterpenoidalglycosidesinducingtwonewsapogenolsfromAlbizziaecortex(V).ChemPharmBull,1992，4012:3269-3273;MakatoKaneta，HiroshiHikichi，SeiichiEndo,etal.IdentificationofflavonesinsixteenleguminosaeSpecies.AgricBiolChem，1980，44(6):1407-1410;邹坤，赵玉玺等合欢皮的脂溶性成分[J]，北京大学学报(医学版)1999.7]，合欢花的化学成分及合欢荚果的挥发性成分亦做了研究[李作平等合欢花化学成分的研究[J]中国医药杂志[J]2000，25(2):103-104;吕金顺，朱巧军，王亚平等合欢荚果挥发油的化学成分研究[J]兰州大学学报(自然版)2003,39(1):59~61]。合欢皮及花虽然是重要的中药，但用其皮或花后，会损坏树木，破坏环境。合欢荚果一般在秋天结果后作为废料任其自然消失，未充分利用。
发明内容本发明的目的在于提供一种合欢荚果提取物及其制备方法与抗菌剂，对合欢荚果进行提取，从中寻找药物活性成分，并对其进行未发现的药理活性研究，达到充分利用广泛存在的这一植物资源，以期开发出更高效的植物源杀菌剂。本发明的技术解决方案是合欢荚果提取物是以合欢荚果为原料，原料在提取溶液中浸提后通过分离溶剂萃取，萃取相蒸馏得提取物。本发明的合欢荚果提取物是按照下述方法制备的工业酒精和碱溶液混合组成提取溶剂，己粉碎的合欢荚果与提取溶液混合，加热回流，得到的提取液用酸调节PH值至4-6，蒸馏至提取液的二分之一体积后，依次用分离溶剂石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇分别进行萃取；四种萃取相经蒸馏得四种提取物。上述方法中，所述的合欢荚果为成熟的合欢J/6/zz/ayw/An'肌'wDurazz.的带荚果实。上述方法中，所述的合欢荚果粉碎至5-18目；优选8-10目。上述方法中，所述的碱为NaOH，质量分数为3-10%;优选3-6%质量分数。上述方法中，所述的提取溶剂由1~6体积的工业酒精与13体积的碱组成；优选工业酒精与碱的体积比为2:1。上述方法中，所述的合欢荚果与提取溶剂按合欢荚果重量lg与5-10ml提取溶剂进行浸提；优选合欢荚果重量lg与8mL提取溶剂进行浸提。上述方法中，所述的热回流温度60-90°C，回流3次，每次回流时间为60-180min;优选回流时间90min。上述方法中，所述的热过滤分离得到的提取液调节PH值至4-6所用酸为盐酸或硫酸。上述方法中，所述的分离溶剂为石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇，依次在分液漏斗中进行。上述方法中，萃取相是在旋转蒸发仪中进行蒸馏得到提取物。本发明的抗菌剂，是以合欢荚果提取物为有效活性成份；其中乙醚提取物对大肠杆菌(&c/^n'c/H'a.co//)、金黄色葡萄球菌OS鄉/iy/ococc肌awre—、沙门氏菌sp)、巨大芽孢杆菌(^ac/〃ws.m^gaten'wm)、枯草杆菌(5sci72w51.5^6z^'7i5)、铜乡录假单抱菌0^/附0^//"々/^/)的抑制较强，尤其是对巨大芽孢杆菌和枯草杆菌。本发明的有益效果是1、合欢荚果石油醚乙醚、乙酸乙酯或正丁醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、枯草杆菌、铜绿假单孢菌具有不同的抑制作用，其中乙醚提取物对上述菌的抑菌较强；2、利用合欢荚果提取物制备的抗菌剂具有绿色环保、低毒无害等优点，充分利用我国现在未开发利用、但又分布非常广泛的合欢荚果资源；3、与其他利用植物的根、茎、花来提取活性物比较，本发明具有不破毁植物资源，充分利用植物废弃物的特征，符合可持续发展的战略要求；4、为开发新的抗菌剂提供了切实可行的关键技术，为扩大我国植物性抗菌剂提供新的技术支持。图1为提取时间对提取率的影响图2为粉碎颗粒大小对提取率的影响图3为碱与工业酒精体积比对提取率的影响图4为合欢荚果质量与提取溶剂体积比对提取率的影响具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本发明只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述内容作出一些非本质的改进和调整。该实施例中所用的合欢荚果为i^一月成熟的合欢J/6/zz^>//6〃'肌>7Durazz.的带荚果实。实施例l:提取溶剂的选择取50g粉碎至8目的合欢荚果，用体积百分比浓度为95%的工业酒精150mL，50mL质量分数6%的NaOH溶液和工业酒精100mL组成的提取溶剂，或150mL质量分数3%的NaOH溶液，或150mL的水，或150mL的质量分数为3%的盐酸溶液分别浸泡，在8(TC下热回流3小时，趁热过滤，重复三次，合并三次提取液。将提取得到的提取液调节PH值至4-6后旋转蒸馏，蒸馏至原提取液的二分之一体积；在工业酒精提取液中直接加入80目的硅胶10g，搅拌均匀后继续蒸馏至得到松散状物，松散状物依次用分离溶剂石油醚、乙醚、乙酸乙酯在索氏提取器中分离提取，最后在烧杯中用正丁醇超声分离提取；其余各提取液依次用分离溶剂石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇在分液漏斗中进行萃取；以上各分离溶剂的萃取相经旋转蒸馏得到不同提取溶剂的提取物，其提取率=(各提取物的质量/所用合欢荚果的质量)X100%，具体数值见表l。表1.用不同溶剂提取合欢荚果所得的提取率/%_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从表1可见，碱工业酒精混合溶液做提取溶剂时，其各分离提取物和总的提取率较高。实施例2:提取时间的选择质量分数为6%的NaOH溶液50mL与100mL的工业酒精混合组成提取溶剂，取20g粉碎至8目的合欢荚果5份，在提取溶剂中分别浸》包，在80。C下分别热回流20min、60min、90min、20min、150min，趁热过滤，重复三次，合并三次提取液。将以上碱工业酒精提取得到的提取液用盐酸调节pH值至4-6后减压蒸馏，蒸馏至原提取液的二分之一体积，依次用分离溶剂石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇在分液漏斗中进行萃取；各分离溶剂的萃取相经蒸馏得到不同提取溶剂的提取物，按照以上计算提取率的公式计算提取率，具体数值见图l。从图1可见，最佳提取时间为90min。实施例3:合欢荚果粉碎颗粒大小的选择具体操作与上述实施例2相同，固定提取时间为90min，合欢荚果颗粒大小为5目、8目、10目、18目分别进行提取，按照以上计算提取率的公式计算提取率。结果显示，目数越大，颗粒越小，提取率越高，但颗粒太小，后续分离越加困难。因此，最佳颗粒选8-10目。结果见图2。实施例4:碱工业酒精体积比的选择具体操作与上述实施例3相同，合欢荚果粉碎颗粒大小为10目，用6y。质量分数NaOH溶液与工业酒精按照l:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6体积比组成提取溶剂分别浸提，按照以上计算提取率的公式计算提取率。结果显示，碱与工业酒精的体积比l:1-1:3之间较好，最佳为l:2。结果见图3。实施例5:合欢荚果的质量与提取溶剂体积比的选择具体操作与上述实施例4相同，固定提取时间为90min,合欢荚果粉碎颗粒大小为10目，6%的NaOH溶液与工业酒精以1:2的体积比组成提取溶液，合欢荚果的用量与提取溶剂的体积比按lg:5mL、lg:6mL、lg:8mL、lg:9mL分别进行提取，按照以上计算提取率的公式计算提取率。结果显示，最佳合欢荚果质量与提取溶剂体积比为lg:8ml。结果见图4，应用实施例合欢荚果提取物的抗菌活性选实施例1中"提取溶剂的选择"所得到的合欢荚果各提取物进行抗菌活性试验，其试验是对几种常见病菌按照下述方法测定抑菌活性的准确称取各提取物用体积比浓度70%乙醇溶液溶解成质量体积浓度为100mg/ml溶液；同样方法配置对照品青霉素溶液。菌悬液制备用无菌水洗涤培养24h的供试菌株，制成含菌浓度在106-107cfii菌悬液。菌平板制备取0.1ml上述菌悬液，在无菌条件下均匀地涂布在普通牛肉膏蛋白胨培养基上，于37'C培养24h。最低抑菌浓度(MIC)的测定取100mg/mL各提取物和青霉素溶液l.OmL采用2倍稀释法得各梯度浓度溶液。在各培养皿内分别加人1mL各梯度浓度的溶液，然后每个培养皿中倒入19rnL已溶化的固体培养基，充分混匀，使其成为2500|ig/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5jig/mL、106.25(Xg/mL、53.125(ig/mL、26.56pg/mL、13.28ng/mL、6.64pg/mL、3.32pg/mL梯度浓度的溶液，待冷却凝固后，采用影印法，用毛细管一端将测试菌株分别影印于含不同药物浓度的每个培养皿上，于37。C恒温箱中培养24h，观察结果，菌不生长的最低浓度即为合欢荚果提取物最小抑菌浓度(MIC)。实验结果见表2。表2.不同提取溶剂所得的各提取物和对照物青霉素对所选菌的最低抑菌浓度(MIC)值萃取物种类最低抑菌浓度MIC(ng/ml)24h绿脓杆菌沙门氏菌大肠杆菌S妙WS.s/co//金葡菌巨大芽孢杆菌枯草杆菌酒精乙醚碱乙醚混合提取剂乙醚水乙醚酸乙醚250012501250250025001250312.5625312.512502500312.5106.25312.512502500酒精正丁醇碱正丁醇混合提取剂正丁醇水正丁醇酸正丁醇2500酒精石油醚碱石油醚混合提取剂石油醚水石油醚酸石油醚106.25酒精乙酸乙酯碱乙酸乙酯125012混合提取剂乙酸乙酯-1250——水乙酸乙酯---——酸乙酸乙酯_--_I_:_^_^_对照青霉素_^_^_:_^_^_2500注"-"表示最低抑菌浓度大于250C^g/mL;E.coliC&cten'c/w'aco/!'-)大肠杆菌，S.aureus(StopA少/ococcjiy.m^ewj-)金黄色葡萄球菌'S.sp.(i9a/7ncwe//o.Sp.-)、沙门氏菌，B.megaterium(Sac"/肌/wegaZen'ww-)巨大芽孢杆齒，S.typhi(&/wowe//<z铜绿假单孢菌=绿脓杆菌，B.subtilis(Sac/肠.raM嗣枯草杆菌结果表明，在同一提取溶剂下，所得到的不同提取物中乙醚提取物抗菌活性最强，尤其是对巨大芽孢杆菌、枯草杆菌两种菌具有很好的抑制作用。结果还表明，多种提取溶剂提取物中，用碱工业酒精组成的提取溶剂所得的乙醚提取物提取率高于其他提取溶剂中的乙醚提取物。权利要求1、合欢荚果提取物，其特征在于合欢荚果提取物是以合欢荚果为原料，原料在提取溶剂中浸提后通过分离溶剂萃取，萃取相蒸馏得提取物。2、合欢荚果提取物的制备方法，其特征在于工业酒精和碱溶液混合组成提取溶剂，已粉碎的合欢荚果与提取溶剂混合，加热回流，得到的提取液用酸调节PH值至4-6，蒸馏至提取液的二分之一体积，依次用分离溶剂石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇分别进行萃取；萃取相经蒸馏得到四种提取物；所述的合欢荚果为成熟的合欢J/Wzz/a^/^/肌'wDurazz.的带荚果实；所述的合欢荚果粉碎至5-18目；所述的碱为NaOH，质量分数为3-10%;所述的提取溶剂由1~6体积的工业酒精与1~3体积的碱组成；所述的合欢荚果重量lg与5-10mL提取溶剂进行浸提；所述的热回流温度60-8(TC，回流3次，每次回流时间为60-180min;所述的热过滤分离得到的提取液调节pH值至4-6，所用酸为盐酸或硫酸。3、根据权利要求2所述的合欢荚果提取物的制备方法，其特征在于合欢荚果粉碎至8-10目。4、根据权利要求2所述的合欢荚果提取物的制备方法，其特征在于碱的质量分数为3-6%。5、根据权利要求2所述的合欢荚果提取物的制备方法，其特征在于工业酒精与碱的体积比为2:1。6、根据权利要求2所述的合欢荚果提取物的制备方法，其特征在于合欢荚果质量lg与8ml提取溶剂进行浸提。7、根据权利要求2所述的合欢荚果提取物的制备方法，其特征在于每次热回流时间90min。8、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的四种提取物分别是由分离溶剂石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取所得的提取物。9、抗菌剂，其特征在于该抗菌剂以合欢荚果提取物为有效活性成份。10、根据权利要求9所述的抗菌剂，其特征在于该抗菌剂以乙醚提取物为有效活性成份，抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、枯草杆菌、铜绿假单孢菌，尤其是抑制巨大芽孢杆菌或枯草杆菌。全文摘要本发明公开了一种合欢荚果提取物及其制备方法与抗菌剂，合欢荚果提取物是以合欢荚果为原料，原料在提取溶剂中浸提后通过分离溶剂萃取，萃取相蒸馏得提取物。由本发明得到的提取物配制的抗菌剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、枯草杆菌、铜绿假单孢菌具有不同的抑制作用，其中乙醚提取物对上述菌的抑菌最强，特别是对巨大芽孢杆菌、枯草杆菌的抑制效果高于青霉素。本发明充分利用我国现未开发利用的合欢荚果资源，为开发新的抗菌剂提供了切实可行的关键技术，为扩大我国植物性抗菌剂提供新的技术支持。文档编号A01N65/20GK101461386SQ20081024275公开日2009年6月24日申请日期2008年12月30日优先权日2008年12月30日发明者吕金顺,王新风申请人:淮阴师范学院