专利名称：：防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及植物生物防治技术，特别是一种防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法，具体说是防治黄瓜猝倒病、黄瓜立枯病、黄瓜枯萎病、茄子黄萎病、茄子根腐病、番茄的青枯病以及辣椒疫病等的微生态制剂及制备方法与专用菌株培养方法。
背景技术：
：90年代以来，随着生物
技术领域：
里的关键技术的不断突破和应用范围的不断扩大、农业生态环境及农业可持续发展的迫切要求，农业应用微生物的研究及其产业化进程愈来愈快，由此而产生的农业微生物革命正悄然兴起。生物农药、生物肥料、微生物制剂得到了广泛应用，一方面可使农业资源得到充分的利用，另一方面农业微生物的广泛使用可以大大减少化学农药的使用量，减少环境污染，降低生产成本，提高农产品的品质和效益，增加农产品的市场竞争力，为农业产业结构的调整和创汇提供新的生物产量和资源。近年来，人们逐渐认识到革兰阳性菌在生物防治中的重要作用，特别是芽孢杆菌(万s"77m种类繁多，资源丰富，可以内生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，易于工业化生产和贮藏，应用于生产潜力很大。枯草芽孢杆菌(&c^^ss^ti7A)制剂/ToA'aA已在美国商业化，对植物病原菌/^sar;7z和y/izo"o/7ia有很好的防治效果，同时兼具防病和促进生产的作用。80年代末，我国与国际水稻合作研究开发获得一种生防菌枯草芽孢杆菌，其发酵液防治水稻纹枯病平均为60%85.5%。己有研究表明，因芽孢杆菌能产生内生芽孢，有极强的抗逆能力，想比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，剂型的生产，定殖与繁殖。因此用于防治黄瓜立枯病、黄瓜枯萎病、茄子根腐病、茄子猝倒病、辣椒疫病、番茄的茎基腐病、葡萄的灰霉病、香蕉的炭疽病的枯草芽孢杆菌及其制剂具有很广泛应用研究价值。
发明内容本发明的目的是提供一种防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法，可以克服目前抗病品种单一容易丧失抗病性以及化学农药防治所带来的成本高和污染环境的缺陷。本发明可用于防治黄瓜立枯病、黄瓜枯萎病、茄子根腐病、茄子猝倒病、辣椒疫病、番茄的茎基腐病、葡萄的灰霉病、香蕉的炭疽病等，具有高效、广谱、性能稳定、可工业化生产的土传病害生防菌制剂。本发明提供的防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂是以保藏号为CGMCCNO.2270的枯草芽孢杆菌B579(勘ci77"5^"&力's)的菌体和它的代谢产物作为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体以及抗热保护剂制成；含有效活性成分含菌量为80-800亿个菌体/克；抗热保护剂的质量含量为3-5%。所述的菌体为营养体和/或芽孢。所述的载体为水、滑石粉、锯木屑、粘土、高岭土、藻硅土、碳酸钙、木质素、木质素磺酸钠、十二垸基硫酸钠、烃类、醚类、酮类、芳香烃类、酰胺类等，或它们的混合。所述的抗热保护剂为可溶性淀粉、糊精、蔗糖或谷氨酸钠，或它们的混合。本发明防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂的组成为保藏号为CGMCCNO.2270的枯草芽孢杆菌B579(5sciW"5"s"6z^z^)的菌株，含菌量为8.080.0Xl(Tcfu/g，可溶性淀粉0.41%、糊精11.5%、蔗糖11.5%、谷氨酸钠0.30.6%，余下量为碳酸钙和硅藻土载体，碳酸钙硅藻土二l:12，重本发明可以制成各种剂型，如可湿粉，水剂和可溶性粉剂等，还可以加入其它有效活性成分进行复配以及增效剂、稳定剂，可以大大提高药效和农业上的实用性。本发明选用碳酸钙为载体，碳酸钙颗粒的直径为0.09mm。本发明选用水为载体，其含菌量为5.0X1088.0X101()cfu/nil水。本发明提供的防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法包括的步骤1)菌种活化保藏号为CGMCCNO.2270的枯草芽孢杆菌B579(勘"77〃s幼&7/s)的菌株在LB液体培养基中活化12h，备用；2)种子液制备活化后的B579菌株，在2637t:下震荡1218h，培养后所得B579种子液；3)发酵培养在发酵培养基中，并加入水，初始pH值为6.57.5之间，高温灭菌，然后待温度降到3(TC以下接入步骤2)的种子液，再在温度为2637°C，通气量150200L/h，搅拌速度为150230rpm的条件下发酵培养2236h;4)测定发酵液中菌体数量，待发酵液中芽孢率达到30%50%停止发酵培养，将得到的发酵液与抗热保护剂按计量混合均匀，再将此混合液与载体混合，即得到微生物菌剂。得到微生物菌剂中液体菌体的枯草芽孢杆菌B579的活菌数大于5X108cfu/ml，经过常规浓縮，菌体浓度提高。例如，粉制剂菌体浓度可以达到80-800亿个菌体/克。所述的发酵培养基的组成为酵母膏510gL—\可溶性淀粉816g.L一1、葡萄糖48g'L—\黄豆饼粉816g'L—\牛肉膏612gL人玉米粉816g*L—'，其余为水。所述的发酵培养基中可加入植物油或者二甲基硅油作为消泡剂。该植物油(例如氢化植物油)的重量百分比可为12%;该二甲基硅油的重量百分比可为0.41.0%。本发明提供的防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂的使用方法是将菌剂直接施撒在田的地表植物根部附近，然后用水灌溉，即可达到控制土传病害的目的，可有效防治黄瓜立枯病、黄瓜枯萎病、茄子根腐病、茄子猝倒病、辣椒疫病、番茄的茎基腐病、葡萄的灰霉病、香蕉的炭疽病。本发明的防效达70%以上，并且对植物生长有明显的促进作用，具有高效、抑菌谱广、使用简单、成本低、无环境污染、改善土壤微生态环境的特点。具体实施方式本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。本发明的枯草芽孢杆菌菌株B579(^gc/WMs^"7/s)，已于2007年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏中心编号CGMCCNO.2270。实施例h枯草芽孢杆菌B579的发酵步骤如下-将枯草芽孢杆菌菌株B579(5aciW〃5幼6"力's)接到装有第一培养基的玻璃器平皿A上，37°C、培养12h的活化培养而得到菌株B579;将活化后的菌株B579接种到装有30mL第二培养基的250mL的三角瓶中，并发酵12h而得种子液。接种量110%，接种时间416h，转速100200r/min的培养条件较好。尤以接种量1%，接种时间12h，转速180r/min最佳。将种子液以3y。移入装第三培养基的7L发酵罐中，温度37'C，接种量，发酵时间2226h，转速100200r/min。其中，第一培养基配方为土豆200g/L，琼脂20g/L，pH自然。第二培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5/L，氯化钠10g/L，pH7.5。第三培养基酵母膏510gL人可溶性淀粉816gL—\葡萄糖48g'L—1、黄豆饼粉816g'lA牛肉膏612g'L—1、玉米粉816gL一1，PH值为6.58.0。第四培养基的配方为酵母膏6gL—1、可溶性淀粉11gL—\葡萄糖6gL-、黄豆饼粉13.97glA牛肉膏8.89gL-、玉米粉12.57gL一1，PH值为6.58.0。第三培养基、第四培养基的pH值7.5最佳。上述得到的枯草芽孢杆菌B579(As^77m幼力"7A)的生理生化鉴定方法如下V-P试验将细菌接种在以下培养基中蛋白胨9g，葡萄糖5g，蒸馏水1000mL。37'C培养一天，每毫升培养基加入氢氧化钠溶液，充分振荡，l小时内出现红色为阳性反应。分解酪氨酸试验在培养基中加入1%的酪氨酸，充分摇匀后制备平板，将细菌接种于37'C条件下培养两天，逐日观察，如果在菌落周围或者菌落下面产生了透明区域，表示酪氨酸被水解。淀粉水解试验细菌可以产生淀粉酶，将淀粉水解为糖类，测定用培养基为牛肉膏2.0g/L，蛋白胨17.5g/L，淀粉1.5g/L，琼脂17.0g/L，pH7.0。细菌接种于以上培养基平板上，于37'C培养24小时，在平板上加入碘液(其配方为碘1.0g/L，碘化钾2.0g/L)，培养基呈现深蓝色，菌落周围为无色透明或者浅棕色为阳性反应。糖类产酸和产气试验采用Ayer's基本培养基酵母膏0.2g/L，NH4H2P041.0g/L，KC10.2g/L，MgS04'7H200.2g/L，溴百里酚蓝1.5mL，pH7.0。以上基本培养基分装在试管中，加入杜氏小玻璃管，于12rc20分钟灭菌后加入过滤灭菌的碳水化合物，使终浓度为1%，用接种环蘸细菌悬浮液接种，以不含有待测碳素化合物的培养基为对照。在37"C培养2天，观察细菌是否生长，如果培养基变为黄色，表示产酸。硝酸还原试验采用硝酸盐培养基硝酸钾0.2g，蛋白胨5g，牛肉膏3g，蒸馏水1000mL，PH7.4。将试验菌接入硝酸盐培养基试管中，37"C培养一天，向试管中加入3滴甲液(其配方为0.8g对氨基苯磺酸溶解于100mL5mol/L乙酸中)，摇匀，再加入3滴乙液(其配方为0.5ga-苯胺溶解于100mL5mol/L乙酸中)，摇匀，变红色者说明试验均能还原硝酸亚为亚硝酸盐。柠檬酸盐试验采用西蒙氏柠檬酸盐培养基NaCl5g/L，MgS04*7H200.2g/L，(NH4)H2P04lg/L，柠檬酸钠5g/L，琼脂20g/L，0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mL，pH6.8。在斜面培养基上划线接入试验菌，在37'C培养4天，逐天观察培养基颜色变化。培养基由草绿色变成蓝色者，为柠檬酸盐利用试验阳性。耐盐性试验耐盐性培养基蛋白胨2g，氯化钠按不同量添加(1%、3%、7%、9%、11%、14%)蒸馏水100mL，pH7.7。向培养基中接入试验菌，在37。C培养l天，观查结果。未列出的试验方法采用《伯杰细菌鉴定手册》推荐生理生化测定方法对该枯萎病生防菌进行生理生化特征测定。实施例2:枯草芽孢杆菌B579菌剂(下称生防细菌B579)的制备步骤1)菌种活化将保存-6'C的枯草芽孢杆菌菌株B579在PDA平板培养基上进行活化(3CTC)，挑取单菌落在PDA斜面培养基上扩繁备用；2)种子液的制备按照常规方法制作LB液体培养基，在250mL三角瓶中装入LB液体培养基30mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤l)中的一环上述活化好的B579菌株，在摇床上进行震荡培养，转速180rpm,并在37'C下培养12h，所得可作为种子液；3)B579发酵培养基的制备在7L发酵罐中，加入酵母膏30g、可溶性淀粉55g、葡萄糖30g、黄豆饼粉70g、牛肉45g、玉米粉63g，然后加水5L，搅拌混合得发酵培养基；在12rC对发酵培养基进行灭菌20分钟，再降温到3(TC备用；4)发酵培养向步骤3)所得发酵培养基中接种步骤2)所得种子液150mL;在37。C很温培养24h,同时辅以转速180rmp，通气量200L/h，进行发酵培养；5)18h以后，每隔30min从步骤4)的发酵罐中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率；芽孢率达到50%即可停止发酵培养；发酵培养24h的枯草芽孢杆菌B579液体制剂。6)向步骤5)中发酵液中添加抗热保护剂(可溶性淀粉0.46%、糊精1.25%、蔗糖1.22%、谷氨酸钠0.37%)并混合均匀，得到枯草芽孢杆菌B579制剂的混合物。7)将步骤6)中制得的混合物与载体(硅藻土碳酸钙=2:1)混合均匀，再在进口温度180。C，出口温度为70。C，进料速度60mL/min,喷头压力0.lMPa的条件下喷雾千燥，得到枯草芽孢杆菌B579粉制剂。实施例3生防细菌B579菌剂在防治植物土传病害上的应用。用实施例2中的枯草芽孢杆菌B579发酵液制作而得的枯草芽孢杆菌B579液体制剂(含量活菌数为5.0Xl()S8.0Xl(^cfu/ml)，在天津植保所做了些试验。①枯草芽孢杆菌B579浸泡种子不同时间对黄瓜发芽的影响。用细菌B579的发酵液10mL浸泡黄瓜种子，然后将种子分别放置于铺有双层滤纸的灭菌的平皿中，每天向平皿中注射5ml无菌水保湿催芽(25°C)，36h调查黄瓜发芽率和芽长。②生防细菌B579对黄瓜苗期立枯病的防治试验(盆栽试验)试验在温室条件下(25°C)进行，将营养钵装入已灭菌的土壤，待用。该试验设3个处理处理l:用立枯丝核菌菌悬液浇灌土壤，然后播种事先用B579浸泡6小时的黄瓜种子。处理2:浇灌B579发酵液+立枯丝核菌菌悬液然后播种干籽。处理3:浇灌立枯丝核菌菌悬液然后播种干籽作对照。每个处理10个营养钵，每钵播种5粒种子，试验设四次重复。③生防细菌B579对黄瓜枯萎病的防治试验(盆栽试验)在温室培育无病黄瓜苗(营养土经12(TC高温lh，杀灭土中病原微生物)，待3片真叶展开时试验。本试验采用生防细菌预防和治疗两种方法防治黄瓜枯萎病，设预防、治疗与清水对照三个处理，每处理重复3次，每次30株。预防为接种病原菌(菌悬液浓度为106)前24h接种用生防细菌B579灌根(10scuf/ml)，治疗为接种病原菌后24h用生防细菌B579灌根处理，每株浇灌生防细菌10ml。病原菌接种采用伤根后浇灌病原菌孢子悬浮液方法，每株接菌10ml。调查发病情况，计算发病率和防病治疗效果。④生防细菌B579对黄瓜发芽的影响(平皿试验)用生防细菌B579的发酵培养10ml菌液(菌量为108CUf/ml)浸泡黄瓜种子，考虑到发酵培养基质会对黄瓜发芽有一些影响，故设培养基质和清水两个空白对照，共3处理，每个处理4次重复，每个重复50粒种子，浸种时间6小时，然后放置于平皿中催芽，24h后调査黄瓜发芽率和芽长。⑤生防细菌B579处理对黄瓜生长的影响(盆栽试验)本试验设4个处理，处理l:用生防细菌B579浸泡黄瓜种子6小时，然后播种于营养播中，处理2:用清水浸泡黄瓜种子6小时后播种(作为处理1的对照)。处理3:用生防细菌培养液直接浇灌于营养钵的土壤中，然后播种。处理4，用清水浇灌土壤，然后播种(作为处理3的对照)。表l.生防细菌B579对黄瓜生长的影响,<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例4:实施例2的生防细菌B579发酵液(含量109)，为测该菌对辣椒疫霉、禾谷镰刀菌、立枯丝核菌、黄瓜枯萎、茄子枯萎等土传病害的防效做了些试验，结果见表2表2六株生防细菌对土传病原菌的抑菌活性测定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</table权利要求1、一种防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于它是以保藏号为CGMCCNO.2270的枯草芽孢杆菌B579(Bacillussubtlis)的菌体和它的代谢产物作为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体以及抗热保护剂制成，其有效活性成分含菌量为80-800亿个菌体/克，抗热保护剂的质量含量为3-5％。2、根据权利要求1所述的防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于所述的菌体为营养体和/或芽孢。3、根据权利要求1所述的防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于所述的载体为水、滑石粉、锯木屑、粘土、高岭土、藻硅土、碳酸钙、木质素、木质素磺酸钠、十二烷基硫酸钠、烃类、醚类、酮类、芳香烃类、酰胺类等，或它们的混合。4、根据权利要求l所述的防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于所述的抗热保护剂为可溶性淀粉、糊精、蔗糖或谷氨酸钠，或它们的混合。5、根据权利要求l所述的防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于所述的载体为硅藻土、碳酸钙、甲基纤维素、锯木屑、滑石粉。6、一种防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于它的组成为保藏号为CGMCCNO.2270的枯草芽孢杆菌B579("a"77"s5Y^W")的菌株，含菌量为5.08.0Xl(Tcfu/g，可溶性淀粉0.41%、糊精11.5%、蔗糖11.5%、谷氨酸钠0.30.6%，余下量为碳酸钙和硅藻土载体，碳酸钙硅藻土=1:12，重量比。7、一种如权利要求1所述的防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于用水为载体，其含菌量为5.0X1088.0X10^fu/ml水。8、一种防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤-1)菌种活化保藏号为CGMCCN0.2270的枯草芽孢杆菌B579(fecWJys卯6H/s)的菌株在LB液体培养基中活化12h，备用；2)种子液制备活化后的B579菌株，在2637r下震荡1218h，培养后所得B579种子液；3)发酵培养在发酵培养基中，并加入水，初始pH值为6.57.5之间，高温灭菌，然后待温度降到3(TC以下接入步骤2)的种子液，再在温度为2637。C，通气量150200L/h，搅拌速度为150230rpm的条件下发酵培养2236h;4)测定发酵液中菌体数量，待发酵液中芽孢率达到30%50%停止发酵培养，将得到的发酵液与抗热保护剂按计量混合均匀，再将此混合液与载体混合均匀。9、根据权利要求8所述的的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基的组成为酵母膏510g1/'、可溶性淀粉816gL—'、葡萄糖48gL—'、黄豆饼粉816gL-1、牛肉膏612gL-'、玉米粉816gL-、其余为水。10、根据权利要求8所述的的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基中加入植物油或者二甲基硅油作为消泡剂，该植物油的重量百分比为12%;该二甲基硅油的重量百分比可为0.41.0%。全文摘要本发明涉及一种防治土传病害的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法，是以保藏号为CGMCCNo.2270的枯草芽孢杆菌B579(Bacillussubtlis)的菌体和它的代谢产物作为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体以及抗热保护剂制成；含有效活性成分含菌量为80-800亿个菌体/克；抗热保护剂的质量含量为3-5％。可有效防治黄瓜立枯病、黄瓜枯萎病、茄子根腐病、茄子猝倒病、辣椒疫病、番茄的茎基腐病、葡萄的灰霉病、香蕉的炭疽病。本发明的防效达70％以上，并且对植物生长有明显的促进作用，具有高效、抑菌谱广、使用简单、成本低、无环境污染、改善土壤微生态环境的特点。文档编号A01P3/00GK101401587SQ200810153180公开日2009年4月8日申请日期2008年11月21日优先权日2008年11月21日发明者杨秀荣,敏王,王雪莲,宇郑,骆健美申请人:天津科技大学