专利名称：生物硒和谷胱甘肽在作为鱼饲料添加剂中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及鱼类饵料添加剂领域，具体涉及生物硒和谷胱甘肽在 作为鱼饲料添加剂中的应用。
背景技术：
在海洋养殖中，赤潮毒素中的软骨藻酸(domoicacid，DA)、腹泻 性贝毒、麻痹性贝毒、神经性贝毒等在贝类中储存积累不同，有很大 的危害性，其中软骨藻酸的危害更广，在鱼类与贝类中均可富集，属 记忆缺失性贝毒。到目前为止，世界各地均有DA检出，由此导致的 人和动物的中毒事件层出不穷。另外，违禁渔药中孔雀石绿对我国海 洋养殖水产品质量安全的潜在烕胁尤其严重，已多次造成重大经济损 失，孔雀石绿能结合或插入DNA，促进肿瘤生长，具有明显的高致 癌、高致畸和致突变作用。
而在淡水养殖中，由于水体富营养化导致有害蓝藻水华频频发 生，并可能产生严重危害国民身体健康的蓝藻毒素。其中铜绿微囊藻 M^rao^iy^n^/mwfl水华是世界各国淡水湖泊、池塘中分布广、持 续时间长的一种可能产毒的藻类水华，其产生的毒素称为微囊藻毒素 (microcystin，MC)。其中微囊藻毒素-LR是一种环状七肽肝毒素，最 常见且毒性高。该毒素在肝脏特异聚积，造成细胞内一系列生理生化 反应的紊乱，最终导致肝细胞损伤，甚至发生急性死亡事件。微囊藻 毒素的促肿瘤作用也是通过这种方式实现的。长期饮用或食用含微囊藻毒素的水或水产品可能引发肝癌，特别是在存在肝炎病毒与黄曲霉 毒素的情况下，这种引发肝癌的可能性更高。因此，解决水体微囊藻 毒素的污染对我国国民身体健康尤为重要。
来自水体的微囊藻毒素污染主要有两个污染源， 一个是来自污染 水体的饮用水， 一个是来自污染水体的水产品。对于饮用水微囊藻毒 素污染问题，自来水厂采用物理、化学方法，主要通过专门装置去除 水中微囊藻毒素，但随着水体富营养化进程加剧，自来水厂处理成本 迅速攀升而不堪重负；对于受污染池塘养殖的水产品如罗非鱼等淡水 商品鱼，根本不可能以流体形式的方法在水产品加工过程去除微囊藻 毒素。
另外，由于相关农药的使用，使农药等毒物在淡水养殖鱼体内积 聚。长期食用含有这些药物的水产品可致畸、致癌，也会对人类健康 造成严重威胁。藻毒素、违禁渔药等毒害物质的污染对人类健康所造 成的威胁已引起世界各国公共卫生系统的广泛关注，长期食用含毒素 的水产品可引发肝癌等各种疾病。
如何去除水产品含有的毒素，甚至是否可能利用水产品自身的排 毒机制去除其摄取的毒素，都是目前非常紧迫的课题，在大量的研究 中，人们的目光投向了谷胱甘肽。
谷胱甘肽(glfftathione， GSH)是由Hopkins发现并命名，1929年 Hopkins及Kendall等各自独立的发现其为含有甘氨酸的三肽。谷胱 甘肽化学名为N-(N-L-r-Glutamyl-L-cysteninyl)glycine，艮P N(N-L-r-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸。谷胱甘肽可分为还原型谷胱甘肽(reducedglutathione, GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidizided glutathione, GSSG)。
通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽，是由r-谷氮酸、半胱氨酸、 甘氨酸组成的三肽。
谷胱甘肽是机体内的重要活性物质，它具有清除自由基、解毒、 促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细 胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。还原型谷胱甘肽(GSH)、 氧化型谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和谷胱甘肽还 原酶(GSH-R)共同组成了谷胱甘肽氧化还原系统。该系统具有对抗氧 自由基、保护组织免受氧化损伤的作用，被称为组织抗氧化系统。
谷胱甘肽广泛分布于自然界的生物体中(Wierzbicka等，1989)，主 要存在于酵母、动物肝脏、肌肉、血液中，许多植物，如蔬菜、豆类、 谷物、薯类、菇类及细菌中也含有一定量的谷胱甘肽，在乳制品、熟 食品中含量较低。
目前，谷胱甘肽在畜禽生产中研究较多，已证实谷胱甘肽可以提 高猪卵母细胞成熟率及显微受精胚的卵裂率，提高泌乳动物的泌乳性 能，解除黄曲霉毒素B1对雏鸡的毒性。
在水产养殖相关领域方面，张甬元等发现谷胱甘肽可解除鱼体微 囊藻毒素引起的中毒症。焦采虹曾报道词料中添加GSH可促进罗非 鱼生长和影响氧化应激能力。Zambohino等报道谷胱甘肽能提高鲈鱼 生长速度和成活率。赵红霞等选用初始体质量约8.50 g的草鱼 (CfcW0/7/W072g0^/2 在56 d的饲养期中分别投喂添加5种不
同剂量谷胱甘肽(GSH)(添加量分别为Omg/kg、 100mg/kg、 200 mg/kg、 300mg/kg和400mg/kg)的试验饲料，观察GSH对草鱼生长、 生理指标和抗病力的影响。结果表明，词料中添加GSH不仅能够提 高草鱼特定生长率、存活率和饲料效率，还可以提高草鱼对嗜水气单 胞菌的抵抗能力，其中200mg/kgGSH组草鱼攻毒后存活率达到最 高。以特定生长率为判定指标，GSH在草鱼饲料中的适宜添加量为 350 mg/kg。谷胱甘肽还曾作为强肝剂的一种成分用于水产佴料添加 剂。
然而谷胱甘肽的去毒作用很大程度上依赖于谷胱甘肽过氧化物 酶(GHS-Px)和谷胱甘肽S-转移酶(soluble glutathione S-transferase， sGST), GHS-Px能催化还原型谷胱甘肽(GHS)变成氧化型谷胱甘 肽(GSSG)，同时使有毒的过氧化物还原和分解为无毒物质，此外， 还原型谷胱苷肽本身在可溶性谷胱甘肽S-转移酶(soluble glutathione S-tramferase， sGST)催化下可与多种化学物质包括藻毒素、违禁渔药、 致癌物以及氧化应激产生的各种毒性代谢物发生加合反应，降低毒物 毒性并将其直接经排泄系统排出体外。因此，提高GHS-Px和GST 的活性对于谷胱甘肽的解毒去毒功能有着重要的促进作用。
硒元素(Se)是GHS-Px活性中心的必须组成成分，研究表明机 体适当补充硒元素可显著提高GHS-Px酶的活性，此外，Christensen 等给刚断奶的大鼠分别词以缺乏、足量或超剂量的含硒食物，测定其 肝、肾GST的活性及基因的表达，发现硒对GST的基因表达有影响， 并可能存在一种与硒的生理作用有关的GST基因调控机制。
硒是人体必需的微量元素，具有多种生物学功能。硒与多种酶的活性有关，另外硒可调节维生素A、 C、 E、 K的吸收和消耗，参与 泛醌的合成；促进或增加机体中免疫球蛋白的含量，从而起免疫佐剂 作用。
如果能将生物硒与谷胱甘肽共同作为饵料添加剂喂给鱼类，将可 能大大提高鱼类去毒基因表达，从而增强鱼类对外界毒物的抵抗及分 解排泄能力。目前尚未有将硒与谷胱甘肽一起用作鱼类饵料添加剂的 相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对水产品尤其是养殖鱼类体内毒素，特别是 藻毒素富集严重而现有技术无法很好去除这些毒素，从而导致人类健 康严重受到威胁等问题，提供一种生物硒和谷胱甘肽在作为鱼饲料添 加剂中的应用，含有生物硒和谷胱甘肽的鱼馆添加剂可以促进鱼类去 毒基因的表达，不需对养成的水产品进行任何专门处理，也不需任何 专门的加工装置，鱼类自身就能将摄取的毒素排泄出来，从而保证了 食用鱼的安全性。
本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的 首先，本发明分析了鱼体内去毒体系的作用原理毒素进入鱼肝 细胞后，使细胞中产生大量活性氧分子，这些活性氧分子将脂质分子 氧化为过氧化脂质分子，以自由基链式反应的方式对肝脏造成严重损 伤。这时，在肝脏抗氧化胁迫与抑制过量ROS发生方面起重要作用
的GPX被诱导，过氧化脂质分子在谷胱甘肽过氧化物酶GPX的作用 下，被GSH还原生成GSSG和还原型脂质分子，而sGST则催化GSH与毒素结合，成为水溶性化合物排出体外，起到解毒作用。
目前，对于哺乳动物中外源物质促进GST基因表达的调控机理 研究已有相当的进展。当机体接触外源化学物质产生过氧化压力和亲 电子压力时，发现有超过100个基因会发生应激表达，他们的产物调 控多种细胞活动包括信号传导、增殖和免疫防御反应等。我们对编 码这些抗氧化酶的基因启动子进行功能分析发现了一个顺式转录调 控元件，此元件可以调控这些基因的基础表达及介导异生素或抗氧化 剂刺激的诱导表达。这个元件被命名为抗氧化反应元件(ARE)或亲电 子反应元件(EpRE)。
Rushmore等利用基因敲除技术证实，大鼠GSTl(Ya)亚基基因的 5'侧翼区存在5个独立的调控元件，但是有关鱼类GST5'侧翼区调 控元件的作用，目前远不如哺乳类清楚。
Leaver对比目鱼GSTA、 GSTA1、 GSTA2基因的启动子区域序列 进行比较分析，发现比目鱼GSTA启动子区含4个ARE (或EpRE) 调控元件，GSTA1启动子区含几个可被过氧化物酶体增殖物识别的 序歹U PPRE (peroxisome proliferator response element)禾口 2个ERE (estrogen responSe elelment)调控元4牛，而GSTA2的调控区则不含 任何可识别的启动子元件。对比目鱼GSTA、 GSTA1及GSTA2启动 子进行活性分析发现，比目鱼GSTA启动子活性最高，GSTA1次之， GSTA2最低，认为这可能跟这些基因启动子区含不同的调控元件有 关。比目鱼GTSA基因的表达调控模式，可能跟哺乳类alpha家族 sGST基因相类似，均由一系列亲电子的外源性物质通过ARE诱导GST基因表达，提示GSTA在鱼类及哺乳类的抗氧化应激方面可能 发挥着相似作用。
本发明考虑可以通过生物硒促进去毒基因的转录水平，增强鱼类 去毒能力；而还原型谷胱苷肽本身在可溶性谷胱甘肽S-转移酶 (soluble glutathione S-transferase, sGST)催化下可与多种化学物质包J舌 藻毒素、违禁渔药、致癌物以及氧化应激产生的各种毒性代谢物发生 加合反应，降低毒物毒性并将其直接经排泄系统排出体外。
综上所述，本发明将生物硒和谷胱甘肽用于鱼类饵料添加剂中， 所制备的含生物硒和谷胱苷肽的鱼饲料，其富硒酵母的含量为每公斤 干饲料含有富硒酵母0.5-1.0克，谷胱苷肽的含量为每公斤干词料含 有谷胱甘肽0.8 1.2克。
硒元素的来源有许多种，与亚硒酸钠等无机硒相比，生物硒具有 吸收利用率高,安全性强，无毒副作用，是人体的最佳硒。富硒酵母，属 于生物硒，是目前常用的一种含硒添加剂，在国外已实现工工业化生 产和进入实用阶段。生物硒的含硒量最高可达1000 ppm，但通常为 300ppm左右。其蛋白质含量为55.8%，维生素Bl为3.2ppm，维生 素B2为33.2 ppm，是一种功能性极佳的食品配料。经化学分析表明， 硒在富硒酵母中的存在形式与其在普通啤酒酵母中的天然存在形式 相似，其中有机硒含量占总硒量的95%以上，而有机硒中又有27% 的是以共价键形式结合到大分子(主要是蛋白质)上。硒蛋白中的含 硒分子结构主要以硒代胱氨酸为主，约占83%，而硒代蛋氨酸的含量 则较少。本发明采用富硒酵母作为生物硒的主要来源，富硒酵母可以选用市场上可购买得到的成品，根据其中所含硒的份量按比例混合入 鱼饲料中。
谷胱苷肽选用AMRESCO公司的产品，其纯度>98.0%。
鱼饲料通常是指鱼粉，也可以是价格低廉且含丰富的蛋白质如玉 米、大豆等制成的词料。鱼饲料通常分成蛋白质饲料和能量饲料。其 中蛋白质饲料是指干物质中粗蛋白含量>20%,粗纤维含量《18%的 一类饲料；能量饲料是指干物质中粗蛋白含量《20%，粗纤维含量《 18%的一类饲料。
考虑到饲料营养与容量的关系，既要保证鱼类能摄入足够的营 养，又要能使其产生饱感。所以蛋白质饲料和能量饲料是具备一定的 比例。为了有利于鱼类生长，既要满足鱼类生长对蛋白质的需要，又 要使能量和蛋白质的比例适中，过高和过低的能量蛋白比都不利于鱼 类生长。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果l.本发明提供了一
种生物硒和谷胱苷肽在鱼饲料添加剂中的应用，添加有生物硒和谷胱 甘肽的鱼词料能够促进鱼类去毒基因的表达，从而增强鱼类抵抗外界
毒物的能力；2.根据本发明提供的一种生物硒和谷胱苷肽在鱼词料添 加剂中的应用，在淡水养殖经济鱼类在微囊藻等蓝藻水华高发期、海 水养殖经济鱼类接触赤潮发生或者接触违禁渔药时，给养殖的鱼类喂 投含添加了高效安全生物硒和谷胱苷肽添加剂的鱼饲料，有利于鱼类 自身代谢排除微囊藻毒素以及药物毒素，从而保证鱼类食用的安全 性；3.利用本发明所提供的一种生物硒和谷胱苷肽在鱼词料添加剂中的应用，所制备的鱼饲料，在水产养殖过程中喂投含给鱼类，可以促 进鱼类去毒基因表达特别是I、 II时相代谢去毒相关基因的表达，通 过鱼自身的代谢体系就能够将自身摄入及积累的毒素分解排泄出去， 不需对养成的水产品进行任何专门处理，也不需任何专门的加工装 置，极大地降低了食用鱼的后期处理成本，更加环保经济。
图1为杂交罗3貝鱼(Oeoc/ ram" m'foft'c"ja 按每公斤饲 料中含富硒酵母0.5 g的量喂食后，其GSTA、 GPX基因mRNA表 达的RT-PCR分析柱形其中1为PBS， 2为MC-LR， 3为SE+PBS， 4为SE+MC-LR;
图2为杂交罗非鱼(OwocAr(9/m:y m7orici/ja ""re船)按每公斤饲 料中含富硒酵母l.O g的量喂食后，其GSTA、 GPX基因mRNA表 达的RT-PCR分析柱形其中1为PBS， 2为MC-LR， 3为SE+PBS， 4为SE+MC-LR;
图3为尼罗罗非鱼((9mx^ram^ m7加'c"s)按每公斤饲料中含 GSH0.8 g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表达的 RT-PCR分析柱形其中1为PBS，2为MC-LR， 3为GSH+PBS，4为GSH+MC-LR;
图4为尼罗罗非鱼(OeoWAwm;s m'foric^)按每公斤饲料中含 GSH1.0g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表达的 RT-PCR分析柱形其中1为PBS， 2为MC-LR， 3为GSH+PBS， 4为GSH+MC-LR;图5为尼罗罗非鱼((9m dzram^ m7oft'c""按每公斤饲料中含 GSH1.2g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表达的 RT-PCR分析柱形其中1为PBS， 2为MC-LR， 3为GSH+PBS，4为GSH+MC-LR;
图6为尼罗罗非鱼(O^c/^rom^ m7ofl'c""按每公斤饲料中含富 硒酵母0.6g和GSH1.0g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因 mRNA表达的RT-PCR分析柱形其中1为PBS， 2为MC-LR， 3为SE+GSH+PBS ， 4为 SE+GSH+MC-LR;
图7为鲢鱼(/^7wp/i^zZ/m'c/^/0^ mo/^tc)按每公斤饲料中含富硒 酵母0.6 g和GSH 1.0 g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因 mRNA表达的RT-PCR分析柱形其中1为PBS， 2为MC-LR， 3为SE+GSH+PBS， 4为 SE+GSH+MC-LR。
具体实施例方式
实施例l含生物硒和谷胱甘肽的鱼饲料
含生物硒和谷胱甘肽的鱼饲料的制备方法如下
(1)取购买自广州市圣格王生物技术有限公司的富硒酵母，其含 量组份为(质量百分比)
水分 《10.0% 蛋白质(以N计)》40.0% 灰份 《10.0%硒(以Se计) 300-2000 mg/kg
(2) 取购买自AMRESCO公司的谷胱甘肽，该谷胱甘肽的纯度 >98. 0%:
(3) 按每公斤干饲料含约0.5克富硒酵母，每公斤干饲料含约 0.8克谷胱苷肽的量，分别将富硒酵母和谷胱甘肽混合加入购买自广 州市澳洋实业有限公司鱼饲料中即得。
实施例2含生物硒和谷胱甘肽的鱼词料
含生物硒和谷胱甘肽的鱼饲料的制备方法如下
(1)取购买自广州市圣格王生物技术有限公司的富硒酵母，其含
量组份为(质量百分比)
水分 《10.0% 蛋白质(以N计)>40.0% 灰份 《10.0% 硒(以Se计) 300-2000 mg/kg
(2) 取购买自AMRESCO公司的谷胱甘肽，该谷胱甘肽的纯度 〉98. 0%:
(3) 按每公斤干饲料含约1.0克富硒酵母，每公斤干饲料含约 1.2克谷胱苷肽的量，分别将富硒酵母和谷胱甘肽混合加入购买自广 州市澳洋实业有限公司鱼饲料中即得。
实施例3含生物硒和谷胱甘肽的鱼词料促进鱼类去毒基因表达 的检测
本实施例中，用半定量PCR方法比较不同品种、品系池塘养殖罗非鱼肝脏与肌肉微囊藻毒素去毒酶基因的mRNA相对水平，以p-肌动蛋白为外参照(我们已克隆罗非鱼P-肌动蛋白cDNA序列)，相 对比较罗非鱼不同品种、品系肝脏与肌肉的微囊藻毒素去毒能力。具 体方法详见文献Liang, X. F.， Ogata， H. Y.， Oku， H.， Chen, J.， Hwang， F" 2003. Abundant and constant expression of uncoupling protein 2 in the liver of red Sea bream尸agmsComparative Biochemistry and Physiology A 136: 655-661.
本实施例中，按Liang et al. (2002)方法通过竞争PCR测定组实验 鱼肝脏与肌肉中微囊藻毒素去毒酶基因mRNA数量，确定罗非鱼不 同品种、品系肝脏与肌肉的微囊藻毒素去毒能力。微囊藻毒素去毒酶 基因cDNA竞争模板(定量标准)的制备依照Cell et al. (1993)方法。 具体方法详见文献Liang, X.-F.， Ogata， H. Y., Oku， H., 2002. Effect of dietary fatty acids on lipoprotein lipaSe gene expression in the liver and visceral adipoSe tissue of fed and starved red Sea bream Pagrus major. Comp. Biochem. Physiol. A132: 913-919。
本实施例中，采用黄峙等已成功建立的方法制备生物硒，参照国 际标准确定饲料中适宜的生物硒添加量。生物硒制备具体方法详见文 献黄峙，郑文杰，郭宝江,2002。钝顶螺旋藻富硒培养条件的优化。 生物工程学报，18(3): 373-376。
广东罗非鱼良种场提供不同品种、品系池塘养殖罗非鱼、鲢鱼、 草鱼用于本项研究。
(一)含生物硒的鱼饲料促进鱼类去毒基因表达的检测1、材料和方法 1.1 实验鱼
实验杂交罗非鱼(5~8 g)随机分为两组，每组30条， 一组喂食含 富硒酵母粉的饲料，每公斤饲料中富硒酵母含量分别为0.5g、 l.Og， 另一组喂食含普通酵母粉的饲料以作对照，每天喂食，喂食次数相同， 喂饱为止，喂食一个月以上。驯养期自然死亡率低于10%。鱼类养殖 用水为曝气除氯的自来水，水温为24士2。C，饲养期间连续充氧。随 后每组实验鱼各10尾随机分成2组，每组5尾在自然光照周期下饲 养于室内，用于染毒试验。经人工饲养排毒后的罗非鱼染毒方式采用 腹腔注射，以磷酸缓冲液(PBS)为溶剂，MC-LR (微囊藻毒素)的注 射量为50吗kg—ibwt，对照组直接注射PBS。 24h后冰冻麻醉，分离 肝脏组织。MC-LR为Alexis公司产品公司产品。
实验鱼小心分离出肝脏，肌肉组织从背部取材，迅速称重后用于 提取总RNA。肝脏总RNA提取与纯化使用S.N.A.P. Total RNA Isolation Kit (Invitrogen)， cDNA合成使用lst-strand cDNA Synthesis Kit (Clontech),以oligo(dT)20作为反转录引物。总RNA提取与cDNA 合成均按试剂盒推荐的方法进行操作。
1.2杂交罗非鱼肝脏GSTA、 GPX基因mRNA水平的测定
喂生物硒与对照罗非鱼每组各10尾随机分成2组，每组5尾， 用于染毒试验。染毒方式采用腹腔注射，以磷酸缓冲液(PBS)为溶剂， MC-LR的注射量为50吗kg—1 bwt，对照组直接注射PBS。 24 h后冰 冻麻醉，分离肝脏组织。总RNA提取和cDNA第一链的合成同l.l。以P-肌动蛋白为外参照，采用RT-PCR方法比较杂交罗非鱼肝脏 的GSTA、 GPX基因mRNA相对水平，根据罗非鱼GSTA、 GPX基 因序列设计特异引物D-ONGST01F:5、- AggATCCCAAAgAACgAg-3、和D-ONGST02R:5、- CAgAAACCTgCTgATggC -3、，扩增1条332 bp的GSTA基因cDNA片段；ONGPXOF: 5、-CACCAAGAGAACT GCAAG -3、和ONGPXOR: 5-CACGTCATTCCTACACAC -3、扩增1 条280 bp的GPX基因cDNA片段。
根据已发表的罗非鱼P-肌动蛋白(GenBank: AB037865)设计2 条特异引物D-ONACT01F:5、-CgTgACATCAAAgAgAAgC- 3、和D-ACT02R: 5、-TCTgCTggAAggTggACAg- 3\扩增罗非鱼P-肌动蛋白 cDNA片段(436 bp)。
PCR反应条件为94。C预变性3 min， 94°C 60s， 55°C 60s， 72 °C 60s，共30个循环，最后72'C延伸5 min。指数增长期内终止反 应。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后用凝胶成像 系统及相关软件(Alphalmaget， Alpha Inotech， USA)进行分析，结果 以GSTA、 GPX基因mRNA分别与p-肌动蛋白mRNA的RT-PCR产 物亮度之比(％)表示。
1.3统计分析
采用统计分析软件SPSS 10.0对不同品系罗非鱼肝脏GSTA、GPX 基因MC-LR诱导前后mRNA相对表达水平平均值差异进行统计分 析。若P〈0.05，平均值的差异即认为是显著的。
2、结果2.1微囊藻毒素对喂生物硒与不喂生物硒杂交罗非鱼肝脏
GSTA、 GPX基因mRNA表达的影响
以p-肌动蛋白为对照，测定微囊藻毒素对喂富硒酵母与不喂富硒 酵母罗非鱼肝脏GSTA、 GPX基因mRNA表达的影响。如图1所示， 按每公斤饲料中含富硒酵母0.5 g的量，不喂富硒酵母和喂富硒酵母 的杂交罗非鱼(Oeoc/zram^ m'/oft'ci^O. )在MC-LR (50 jig kg隱l
body weight (bwt))腹腔注射24h后，其肝脏GSTA、 GPX基因mRNA 表达水平均没有显著差异。如图2所示，按每公斤饲料中含富硒酵母 1.0 g的量，不喂生物硒与不喂生物硒杂交罗非鱼在MC-LR (50昭 kg-1 bwt)腹腔注射24h后，其肝脏GSTA、 GPX基因mRNA表达 水平均有升高趋势。
结果证明，在含富硒酵母0.5 1.0g/kg的干饲料添加浓度范围内， 随着浓度的增高，毒素诱导后去毒相关基因GSTA、 GPX的诱导表达 作用越明显，对机体的保护作用越强。
(二)含谷胱甘肽的鱼词料促进鱼类去毒基因表达的检测
随机挑选48尾尼罗罗非鱼用于实验(平均体重17g)，其中，36 尾作为添加剂组喂食含还原型谷胱甘肽饲料(分别0.8、 1.0、 1.2 g/kg)， 12尾作为普通组喂食普通饲料，各组均饱食10天后处理，随后每组 实验鱼各12尾随机分成2组，每组6尾在自然光照周期下饲养于室 内，用于染毒试验。罗非鱼染毒方式采用腹腔注射，以磷酸缓冲液(PBS) 为溶剂，MC-LR的注射量为50吗kg—1 bwt，对照组直接注射PBS。 24 h后冰冻麻醉，分离肝脏组织。MC-LR为Alexis公司产品。以P-肌动蛋白为外参照，采用RT-PCR方法比较罗非鱼肝脏的G STA、 GPX和GSTR基因mRNA相对水平，根据罗非鱼GSTA、 GP X和GSTR基因序列设计特异引物D-ONGST01F: 5、-AGGATCCC AAAGAACGAG-3、和D-ONGST02R: 5-CAGAAACCTGCTGATGG C-3、扩增1条332 bp的sGSTA基因cDNA片段；ONGPXOF: 5、-C ACCAAGAGAACTGCAAG-3、和ONGPXOR: 5-CACGTCATTCCTA CACAC-3、扩增1条280 bp的GPX基因cDNA片段；D-ONGSTR01 F: 5-GAGCACAAGTCCAAAGAAG-3、和D-ONGSTR02R: 5-GCA GATTGTGATACTCTCC-3、扩增1条472 bp的sGSTA基因cDNA片 段。根据已发表的尼罗罗非鱼P-肌动蛋白设计2条特异引物D-ONA CT01F: 5-CgTgACATCAAAgAgAAgC-3、和D-ACT02R: 5、-TCTgC TggAAggTggACAg-3、扩增罗非鱼(3-肌动蛋白cDNA片段(436 bp)。
PCR反应条件为94。C预变性3 min， 94。C 60s， 55°C 60s， 72 °C 60s，共30个循环，最后72'C延伸5 min。指数增长期内终止反 应。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后用凝胶成像 系统及相关软件(Alphalmaget， Alpha Inotech, USA)进行分析，结果 以GSTA、 GPX和GSTR基因mRNA分别与P-肌动蛋白mRNA的 RT-PCR产物亮度之比(％)表示。
以p-肌动蛋白为对照，测定微囊藻毒素对喂GSH与不喂GSH的 尼罗罗非鱼肝脏GSTA、 GPX基因mRNA表达的影响。如图3、 4所 示，当每公斤干饲料中含0.8 g、 1.0 g GSH的量时，不喂GSH和喂 GSH的尼罗罗非鱼在MC-LR (50吗kg"bwt)腹腔注射24h后，其肝脏GSTA 、 GSTR基因mRNA表达水平变化不明显，GPX基因mRNA 表达水平有升高趋势。如图5所示，当每公斤干饲料中含1.2gGSH的 量时，不喂GSH和喂GSH的尼罗罗非鱼在MC-LR (50吗kg"bwt) 腹腔注射24h后，其肝脏GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表达水平 均有升高趋势。
结果证明，在含GSH0.8 1.2g/kg的干词料添加浓度范围内，随 着浓度的增高，毒素诱导后去毒相关基因GSTA、 GSTR、 GPX的诱 导表达作用越明显，对机体的保护作用越强。
(三)含生物硒和谷胱甘肽的鱼饲料促进鱼类去毒基因表达的检测 尼罗罗非鱼、鲢鱼各24尾用于实验，分别取12尾作为添加剂组 (每公斤饲料中同时喂食富硒酵母0.6g/kg和GSH 1.0g/kg)， 12尾 作为普通组喂食普通饲料，两组均饱食10天后处理，随后每组实验 鱼各12尾随机分成2组，每组6尾在自然光照周期下饲养于室内， 用于染毒试验。罗非鱼染毒方式采用腹腔注射，以磷酸缓冲液(PBS) 为溶剂，MC-LR的注射量为50吗kg—1 bwt，对照组直接注射PBS。 24h后冰冻麻醉，分离肝脏组织。MC-LR为Alexis公司产品。
以卩-肌动蛋白为外参照，采用RT-PCR方法比较尼罗罗非鱼、鲢 鱼肝脏的GSTA、 GPX和GSTR基因mRNA相对水平，根据尼罗罗 非鱼、鲢鱼GSTA、 GPX和GSTR基因序列设计特异引物 D-ONGST01F: 5 - AGGATCCCAAAGAACGAG-3、； D-ONGST02R: 5-CAG AAACCTGCTGATGGC-3、； scGSTA01F: 5-GACCTTAAAGAACGGGCT-3、；scGSTA02R: 5-GGAACTTGCTGATTCTTGG-3、分别扩增332、
334 bp的2条GSTA基因cDNA片段；
ONGPXOF: 5-CACCAAGAGAACTGCAAG -3、；
ONGPXOR: 5、-CACGTCATTCCTACACAC-3、；
scGPXOF: 5-GTGAACAGGAATGACATCG-3、；
scGPXOR: 5、-AGTGGACGGTCTATCTTGC-3、，分别扩增280、
192 bp的2条GPX基因cDNA片段；
D-ONGSTR01F: 5-GAGCACAAGTCCAAAGAAG-3、； D-ONGSTR02R: 5-GCAGATTGTGATACTCTCC-3、； scGSTR01F: 5-TGTGCAGAAGTGAAGGCT-3、； scGSTR02R: 5、-CATAATACTCCATCAGTCG-3、，分别扩增472、
457 bp的2条GSTR基因cDNA片段。
根据已发表的罗非鱼、鲢鱼(3-肌动蛋白设计条特异引物
D-ONACT01F:5，-CgTgACATCAAAgAgAAgC- 3，；
scACT01F:5，-CGTGACATCAAGGAGAAGC-3，；
D-ACT02R:5，-TCTgCTggAAggTggACAg-3，，均扩增罗非鱼、鲢鱼p-肌动蛋白cDNA片段(436 bp)。
PCR反应条件为94。C预变性3 min， 94°C 60s， 55°C 60s， 72 °C 60s，共30个循环，最后72'C延伸5 min。指数增长期内终止反 应。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后用凝胶成像 系统及相关软件(Alphalmaget, Alpha Inotech, USA)进行分析，结果 以GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA分别与p-肌动蛋白mRNA的RT-PCR产物亮度之比(％)表示。
以P-肌动蛋白为对照，测定微囊藻毒素对喂生物硒和GSH、不 喂食生物硒和GSH的罗非鱼、鲢鱼肝脏GSTA、 GSTR、 GPX基因 mRNA表达的影响。如图6、 7所示，按每公斤飼料中喂生物硒0.6 g 禾口GSH1.0g的量，不喂添加剂和喂添加剂的罗非鱼、鲢鱼在MC-LR (50略kg—、wt)腹腔注射24h后，检测其肝脏GSTA、 GSTR、 GPX基 因mRNA表达水平变化。研究发现，罗非鱼喂食添加剂的各实验组 GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表达水平比不喂食添加剂的各实验 组高，喂食添加剂且未染毒实验组比喂食添加剂且MC-LR毒素染毒 后的实验组GSTA、 GSTR基因表达水平稍低，GPX基因表达水平升 高；鲢鱼喂食添加剂的各实验组GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表 达水平比不喂食添加剂的各实验组高，喂食添加剂且未染毒实验组比 MC-LR毒素染毒后的实验组GPX基因表达水平均升高，鲢鱼GSTA 基因表达水平升高。结果证明喂食含有喂生物硒和GSH添加剂的鱼 饲料可使鱼类肝脏中去毒相关基因有不同程度的升高，从而保护机体 受外源毒素的损伤。生物洒和谷胱甘肽在作为鱼饲料添加剂中的应用序列表 SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学
<120>生物硒和谷胱甘肽在作为鱼饲料添加剂中的应用
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〈歸 14
<170> Patenl In version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212〉 DNA <213〉人工序列
<柳> 1
aggatcccaa agaacgag 18
<210> 2
〈211〉 18
<212> DNA <213〉人工序'列
<400> 2
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<210> 3
〈211〉 18
<212〉 D貼
<213> 人工序列
<400> 3
caccaagaga actgcaag 18
<210> 4
<211> 18
<212> , <213>人工序列
<400> 4
cacgtcattc ctacacac
<210〉 5
<211> 19
<212> 鹏 <213>人工序列
<400〉 5
cgtgacatca aag缚aagc
<210〉 6
<211> 19
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 6
tctgctggaa ggt鹏cag
<210> 7
〈211> 19
<212> DM <213>人工序列
<400〉 7
gagc3C3agt cc;taag33g
权利要求
1、生物硒和谷胱甘肽在作为鱼饲料添加剂中的应用，其特征在于所述应用为在鱼饲料中同时加入生物硒和谷胱甘肽。
2、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述生物硒为富硒 酵母，其用量为每公斤干粉饲料中含有富硒酵母0.5 1，0克。
3、 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述谷胱甘肽 的用量为每公斤干粉饲料中含有谷胱甘肽0.8~1.2克。
全文摘要
本发明公开一种生物硒和谷胱甘肽在作为鱼饲料添加剂中的应用，其中生物硒的用量为每公斤干粉饲料中含有富硒酵母0.5～1.0克，谷胱甘肽的用量为每公斤干粉饲料中含有谷胱甘肽0.8～1.2克。根据本发明的应用所制备的添加有生物硒和谷胱甘肽的鱼饲料，能够促进鱼类去毒基因的表达，特别是I、II时相代谢去毒相关基因的表达，不仅增强鱼类抵抗外界毒物的能力，有利于鱼类通过自身的代谢体系分解排除微囊藻毒素以及药物毒素，从而保证鱼类食用的安全性，不需对养成的水产品进行任何专门处理，也不需任何专门的加工装置，极大地降低了食用鱼的后期处理成本，更加环保经济。
文档编号A23K1/16GK101438768SQ20081002924
公开日2009年5月27日 申请日期2008年7月4日 优先权日2008年7月4日
发明者珊 何, 刘秀霞, 李光照, 李观贵, 群 林, 梁旭方, 琳 王, 程伟轩, 胡永乐, 陈小佳 申请人:暨南大学