专利名称：利用分子标记辅助选择快速转育青花菜不育系的方法
技术领域：
本发明属于杂种优势利用领域，具体地说，本发明涉及一种青花菜胞质雄性不育系的选育技术，特别是一种利用分子标记辅助选择快速培育青花菜雄性不育系的方法。
背景技术：
青花菜，隶属十字花科(Cruciferae)芸薹属甘蓝种中以绿或紫色花球为产品的一个变种，一、二年生草本植物。学名Brassica oleracea L.var.italica Planch.染色体数2n＝2x＝18。青花菜富含维生素C、维生素B1、B2、B5等，并含有抗癌物质，因而深受国内外消费者的欢迎。青花菜是由甘蓝演化而来，演化中心为地中海东部沿岸地区。在我国栽培历史很短，但发展很快，在我国已经成为一些地区出口创汇的重要蔬菜。八十年代，我国开始引进了一些国外青花菜品种；九十年代，青花菜种植面积快速增长，但国内青花菜育种远远落后于十字花科其他种类。目前我国的育种主要以提纯复壮、系统选育的传统育种方法为主。生产上应用的品种90％以上依赖进口，生产上亟待培育有自主知识产权的优良品种。
青花菜是典型的异花授粉作物，品种或自交系间的一代杂种存在明显的杂种优势。目前杂交品种多采用自交不亲和系，但是由于亲本繁殖困难，有时会因多代自交后自交系生活力下降，而且易受环境影响，很难保证100％的杂交率。雄性不育系是青花菜生产一代杂种的理想系统。因此，青花菜雄性不育系的选育及其应用研究深受重视。选育并利用雄性不育系生产一代种子，可简化制种手续，节省成本，并能确保一代杂种的种子纯度。青花菜胞质雄性不育系繁制一代杂交种子，其生产成本为自交不亲系的80％左右，杂交种子的杂交率可达到100％，不需要进行杂交种的纯度鉴定，从而节省时间，有利于杂交种子的销售。但是国内青花菜雄性不育系的选育起步较晚，对雄性不育遗传规律的认识还停留在形态学和细胞学水平，产生雄性不育的分子机理还不清楚，国内青花菜种质资源较为缺乏而且遗传背景狭窄，国外引进的雄性不育系均为杂种F1代，选育可供生产上利用的不育系还需要通过转育、选择配合力测定等一系列工作，转育周期很长，限制了雄性不育系在生产上的进一步应用。
分子标记方法是实现作物快速、高效育种的手段。它不受环境因素变化的影响，结果可靠，其技术的核心是获得与育种目标性状紧密连锁的分子标记，通过PCR技术实现其辅助育种的目标。目前已获得了不少与青花菜质量性状紧密连锁的分子标记，并得到了广泛应用。但同青花菜不育系和保持系特异连锁的分子标记尚未见报道。所以本发明在鉴定分离青花菜不育系或保持系紧密连锁的分子标记基础上，建立分子标记辅助选择方法快速转育青花菜雄性不育系的方法。由于利用青花菜胞质雄性不育系繁制杂交种子节约成本，可降低杂交新品种种子价格，因而有利于新品种的迅速推广，能够使新品种更快发挥出巨大的社会效益。
发明内容
本发明的目的是针对目前青花菜杂交种常规制种成本高、杂交种子主要依赖进口、价格昂贵且纯度及种源难以保证这一现状，提出一种利用分子标记辅助选择快速转育青花菜胞质雄性不育系的方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的，包括以下步骤1.选择青花菜胞质雄性不育杂合体为母本，以优良的青花菜自交系为轮回亲本，进行常规有性杂交，所得的杂种一代F1再与轮回亲本回交，得到回交一代BC1F1分离群体，种植于田间；2.利用与雄性不育连锁的特异分子标记，其具序列1，序列2的特征；采用聚合酶链式反应PCR检测并对上述植株苗期选择含目标基因的单株；3.利用与优良保持系具有紧密连锁性的特异SCAR和AFLP标记对上述单株遗传背景实施选择，选出轮回亲本遗传背景最多的单株；4.选取上述入选单株，待开花时以此为母本，以轮回亲本为父本，进行回交，得到回交二代BC2F1；成熟后，选取若干个综合性状好的套袋单株进行收种并种植；5.然后重复步骤2)至步骤4)，通过3-4代的回交就能获得不育性稳定的，纯度较高的青花菜不育系，轮回亲本即为相应的保持系。
所述采用聚合酶链式反应PCR检测方法包括以下步骤1)植株的基因组DNA的提取；2)以序列1(5’-TGC ATTGTCTAGAAGTGGTGA)和和序列2(5’-GAAGAATGAAAAGTGGAATGG)所述的核苷酸分子为引物，对上述基因组DNA进行PCR扩增；3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，凡呈现DNA条带的样品记录即为阳性样品。
所述利用AFLP分子标记筛选遗传背景的方法包括以下步骤
1)利用SDS法提取青花菜回交各世代单株基因组DNA；2)在37℃对各待测单株的DNA进行限制性内切酶MseI和EcoRI双酶消化5小时后，再在65℃灭活30-45分钟，然后加入T4DNA连接酶在22℃连接4小时或室温过夜；3)取酶切连接产物加入EcoRI引物和MseI引物以及TaqDNA聚合酶在56℃的退火温度下进行预扩增；4)取预扩增产物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃递减的退火温度下进行选择性扩增；5)PCR产物在6-8％的聚丙烯酞胺凝胶上点样，在70瓦功率下电泳3-4小时分离PCR产物；电泳完毕取下胶板按银染程序进行染色与显影；6)读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。
本发明具有的有益效果1.利用能稳定遗传的且不受光照、温度环境影响的青花菜胞质雄性不育系作为不育源通过回交转育的方法选育符合育种目标需求的新的青花菜胞质雄性不育系，该方法实用可行。本发明利用该方法育成了青花菜胞质雄性不育系，育成的新的青花菜胞质不育系不受光照或温度的影响能够稳定地遗传，为青花菜的杂种优势利用开创了新的途径；2.通过对与目标基因共分离和紧密连锁分子标记基因型的PCR分析和选择，有效地解决了青花菜常规回交育种中长期存在的连锁累赘问题，即由于不利基因与目标基因紧密连锁致使所得改良体与预期的目标不尽一致的现象；通过运用AFLP技术对各回交后代个体基因组的背景选择，有效地解决了青花菜常规回交育种中轮回亲本基因型恢复的偏离问题，使得在改良目标性状的同时，原轮回亲本所特有的高配合力、强适应性等优良性状得以保持，因而改良体可以替代原轮回亲本直接用于杂种生产；3.利用分子标记辅助选择的方法可以加快不育系转育速度，回交3代即可获得整齐度达到95％以上的雄性不育系。而常规的方法需要7-8代才能达到这个纯度。缩短不育系回交世代，加快育种速度，减少育种的盲目性。使用本发明方法能显著减少各世代群体数量，提高育种效率。其中，BC2代可由常规BC2由800株减少至60株左右，而不影响选择效果。
具体实施例方式
本发明利用分子标记快速培育青花菜不育系的方法，是一种选用特定的分子标记、并结合常规PCR配套技术和普通育种技术的方法。可具体依次进行以下步骤1)选择青花菜胞质雄性不育杂合体725为母本，以综合性状优良的青花菜自交系718为父本，进行常规有性杂交，获得F1代种子。F1单株播于田间，待其开花后，选择2-3个F1单株，取父本718的花粉，授予F1植株上，获得BC1分离群体种子，种植于田间2)先利用特定PCR引物对序列1(5’-TGCATTGTCTAGAAGTGGTGA)和序列2(5’-GAAGAATGAAAAGTGGAATGG)对BC1单株进行分子标记辅助选育，其步骤如下A、DNA样品制备0.2g单株嫩叶样品，加入600μL(预热65℃)提取缓冲液，40μL SDS混匀，65℃水浴30min。加入200μL 5M KAc，冰浴60min。离心20min(4℃，12000g)，上清转入新离心管。0.7倍体积(650μL)异丙醇，离心，去上清，加入120μL TE.加2μL RNase，37℃温浴60min。加400μL TE，600μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，离心10min(10℃，12000g)，上清液转入新离心管。加400μL氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，4℃，12 000g，10min，取上清于新离心管。加1/10体积3M NaAc，2×体积无水乙醇，-20℃，2h，4℃，12000g离心10min。400μL预冷的75％乙醇洗DNA 1次，干燥。溶于100μL TE。取5μL DNA样品在0.8％Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取2μL稀释50测OD260/OD280，检测DNA含量及质量。-20℃保存备用。
B、PCR反应在GeneAMP PCR System9700型PCR仪上进行。PCR反应总体系为20μL，其中样品DNA模板约30ng，1.0×PCR(含Mg2+)反应缓冲液，10mmol/L dNTP，上下游引物10μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U。混匀后进行PCR反应第一步94℃预变性4min，第二步94℃变性保温1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，并循环30次；第三步72℃延伸保温10min，结束反应。C、凝胶电泳配制1.0-1.2％琼脂糖凝胶(含0.5-1.0μg/ml的溴化乙锭)，将15-20μL PCR反应后的样品放入凝胶孔中，4.5-5伏特/厘米的电压进行稳压电泳40-60分钟；取出凝胶，在254nm紫外灯下检测。
D、凡呈现DNA条带的样品记录为阳性样品，相反则为阴性样品。
3)再对上述PCR扩增有条带的单株利用AFLP分子标记技术对BC1F1单株进行遗传背景筛选，选择轮回亲本遗传背景最多的单株留种。其步骤如下A、利用上述SDS法提取青花菜回交各世代单株基因组DNA；B、在37℃对各待测单株的DNA进行限制性内切酶MseI和EcoRI酶切5小时后，再在65℃灭活30-45分钟，然后加入T4 DNA连接酶在22℃连接4小时或室温过夜；C、取酶切连接产物加入EcoRI引物和MseI引物以及Taq DNA聚合酶在56℃的退火温度下进行预扩增；D、取预扩增产物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃递减的退火温度下进行选择性扩增；E、PCR产物在6-8％的聚丙烯酞胺凝胶上点样，在70瓦功率下电泳3-4小时分离PCR产物；F、电泳完毕取下胶板按银染程序进行染色与显影；G、读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。
4)上述单株结球后，根据结球特性，选择商品性好的单株留下，去掉混杂单株；待BC1单株开花时，进行田间育性评价，选取10-15个单株套袋，取父本718的花粉进行授粉。成熟时，再次选出3-4个结实率高，综合性状好的套袋单株，收种。同时父本718自交保留。
5)分别种植收获的单株株系，每个株系各种植20-30株；6)选取上述入选单株，待开花时以此为母本，以轮回亲本为父本，进行回交，得到回交二代BC2F1；成熟后，选取若干个综合性状好的套袋单株进行收种并种植；7)然后重复2)、3)和4)步骤，通过3-4代选育，获得2-3个整齐度较一致株系，收种。
本发明选育新的青花菜胞质雄性不育系方法中，在回交转育过程中，不育株的鉴定标准为全株所有花朵雄蕊无花粉或经过醋酸洋红染色鉴定仅有少数无活力的、畸形花粉粒。
本发明所育成新的青花菜胞质雄性不育系的标准为不育率和不育度均可达到100％。
实施例1、杂交以能够稳定遗传且不受光照、温度等环境条件影响的青花菜雄性不育系725(株高约58cm，开展度70cm，花球直径16.5cm，单球重500g，为胞质雄性不育系，柱头发育正常，雄花无花粉)为不育源，并作为母本。以申请者选择的抗病、丰产的718为轮回父本，进行杂交，获得F1再与轮回亲本杂交，获得BC1代分离群体。收获种子，种植100个单株。
2、PCR分子标记分析1)DNA提取 样品按单株编号，加入600μL(预热65℃)提取缓冲液，40μL SDS混匀，65℃水浴30min。加入200μL 5M KAc，冰浴60min。离心20min(4℃，12000g)，上清转入新离心管。0.7倍体积(650μL)异丙醇，离心，去上清，加入120μL TE.加2μL RNase，37℃温浴60min。加400μL TE，600μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，离心10min(10℃，12000g)，上清液转入新离心管。加400μL氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，4℃，12 000g，10min，取上清于新离心管。加1/10体积3M NaAc，2×体积无水乙醇，-20℃，2h，4℃，1 2000g离心10min。400μL预冷的75％乙醇洗DNA 1次，干燥。溶于100μL TE。取5μL DNA样品在0.8％Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取2μL稀释50测OD260/OD280，检测DNA含量及质量。-20℃保存备用。
2)PCR反应 总体系为20μL，其中样品DNA模板约30ng，1.0×PCR(含Mg2+)反应缓冲液，10mmol/L dNTP，上下游引物(序列1和序列2)10μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U(上海生物工程公司)。混匀后在GeneAMP PCR System9700型PCR仪上进行PCR反应第一步94℃预变性4min，第二步94℃变性保温1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，并循环30次；第三步72℃延伸保温10min，结束反应。
3)凝胶电泳 配制1.0-1.2％葡聚糖凝胶(含0.5-1.0μg/ml的溴化乙锭)，将15-20μL PCR反应后的样品放入凝胶孔中，4.5-5伏特/厘米的电压进行稳压电泳40-60分钟；取出凝胶，在254nm紫外灯下检测。凡呈现DNA条带的样品记录为阳性样品，相反则为阴性样品。所选用的引物，先用序列1和序列2扩增，选择阳性样品。
结果在检测的100个单株中，利用序列1和序列2有83份样品呈现阳性，17份样品呈现阴性。
3、对83份阳性样品利用AFLP分子标记筛选单株的遗传背景。
1)利用SDS法提取青花菜回交各世代单株基因组DNA；2)在37℃对各待测单株的DNA进行限制性内切酶MseI和EcoRI双酶消化5小时后，再在65℃灭活30-45分钟，然后加入T4 DNA连接酶在22℃连接4小时或室温过夜；3)取酶切连接产物加入EcoRI引物和MseI引物以及Taq DNA聚合酶在56℃的退火温度下进行预扩增；4)取预扩增产物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃递减的退火温度下进行选择性扩增；5)PCR产物在6-8％的聚丙烯酞胺凝胶上点样，在70瓦功率下电泳3-4小时分离PCR产物；电泳完毕取下胶板按银染程序进行染色与显影；6)读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。结果从83份候选单株中，选择了26个轮回亲本遗传背景最多的单株留种。
4、选择套袋对上述26份选择的单株，在结球时观察花球商品性和熟性，选取10-15个单株套袋，取轮回亲本718的花粉进行授粉，待BC1单株开花时，进行田间育性评价。成熟时，再次选择4个结实率高，综合性状好的套袋单株收种，即为BC2群体的种子，同时父本718自交保留。
5、继续选择将收种的4个单株，各种植30株，并依次重复步骤2和3的DNA样品制备、PCR分析和AFLP分析；结果获得21个PCR反应为阳性，且轮回亲本遗传背景最多的单株。根据田间性状、花球商品性、株系一致性以及育性等，选择9株套袋，用父本718的花粉授粉；种子成熟后，再根据具体的农艺性状和育种要求，保留了其中综合农艺性状最优秀的6个单株进行收种，即得到BC3株系。(其中，第1个单株后代保留了2株，第2个单株后代保留了1株，第3个单株后代保留了1株，第4个单株后代保留了2株)。
6、连续回交，选择。
将收种的6个单株，各种植25株，根据步骤4进行继续选择，回交后从4个单株上收获BC4种子，BC4按各株系播种，评价各株系花球的整齐度和商品性，选择2个整齐度高度一致株系的优良单株(每个3株)，评价与父本的相似性以及雄性不育性、不育度等。分别同父本718回交，获得BC5代种子。从中选择3个株系即为雄性不育系，命名为ZB718A-1，ZB718A-2和ZB718A-3。三个转育成功的不育系的不育度都达到100％。所选育的不育系为早中熟，生长势强，田间表现抗病性好，球形好，色翠绿。
7、选育的胞质雄性不育系的应用以选育的胞质雄性不育系为母本，以不同熟性的青花菜多代自交系724、716、720、712为父本，配制组合，结果组配后均表现为较强的杂种优势，与724、716、720、712等组配后，植株高度平均增加10cm，与迟熟自交系配制的组合开展度可达90cm以上。表明这些组合优点明显，配制的组合较为成功。这也证实了所转育的雄性不育系的正确性。
8、青花菜胞质雄性不育系ZB718A及其相应保持系718的繁制方法。
选择肥力水平较高，适合青花菜繁种的地区，采用塑料大棚(同其他十字花科作物隔离)作为ZB718A的繁育场所，不育系ZB718A和保持系718以2∶1的比例同时播种，不育系与保持系隔行定植，开花期放蜜蜂(少量生产可进行人工辅助)授粉，同时对保持系植株进行自交留种。结果盛期进行追肥，结合田间病虫害防治，果荚成熟后及时采收脱粒。不育系植株上采集的种子即为繁种所需的不育系种子，而保持系植株上采收的种子即为保持系种子。
权利要求
1.一种利用分子标记辅助选择快速培育青花菜雄性不育的方法，其特征是包括以下步骤1)选择青花菜胞质雄性不育杂合体为母本，以优良的青花菜自交系为轮回亲本，进行常规有性杂交，所得的杂种一代F1再与轮回亲本回交，得到回交一代BC1F1分离群体，种植于田间；2)利用与雄性不育连锁的特异分子标记，其具序列1，序列2的特征；采用聚合酶链式反应PCR检测并对上述植株苗期选择含目标基因的单株；3)利用与优良保持系具有紧密连锁性的特异的AFLP标记对上述单株遗传背景实施选择，选出轮回亲本遗传背景最多的单株；4)选取上述入选单株，待开花时以此为母本，以轮回亲本为父本，进行回交，得到回交二代BC2F1；成熟后，选取若干个综合性状好的套袋单株进行收种并种植；5)然后重复步骤2)至步骤4)，通过3-4代的回交就能获得不育性稳定的，纯度较高的青花菜不育系，轮回亲本即为相应的保持系。
2.根据权利要求1所述的利用分子标记快速培育青花菜雄性不育系的方法，其特征是所述采用聚合酶链式反应PCR检测方法包括以下步骤1)植株的基因组DNA的提取；2)以序列1(5’-TGCATTGTCTAGAAGTGGTGA)和序列2(5’-GAAGAATGAAAAGT GGAATGG)所述的核苷酸分子为引物，对上述基因组DNA进行PCR扩增；3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，凡呈现DNA条带的样品记录即为阳性样品。
3.根据权利要求1所述的分子标记快速培育青花菜雄性不育系的方法，其特征是所述利用AFLP分子标记筛选遗传背景的方法包括以下步骤1)利用SDS法提取青花菜回交各世代单株基因组DNA；2)在37℃对各待测单株的DNA进行限制性内切酶MseI和EcoRI双酶消化5小时后，再在65℃灭活30-45分钟，然后加入T4DNA连接酶在22℃连接4小时或室温过夜；3)取酶切连接产物加入EcoRI引物和MseI引物以及TaqDNA聚合酶在56℃的退火温度下进行预扩增；4)取预扩增产物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃递减的退火温度下进行选择性扩增；5)PCR产物在6-8％的聚丙烯酞胺凝胶上点样，在70瓦功率下电泳3-4小时分离PCR产物；电泳完毕取下胶板按银染程序进行染色与显影；6)读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。
全文摘要
本发明公开了一种利用分子标记快速培育青花菜雄性不育系的方法。包括以下步骤1)以青花菜胞质雄性不育杂合体为母本，以优良的青花菜自交系为父本，进行有性杂交；并以该自交系为轮回亲本，进行连续回交；2)利用PCR检测技术，对各回交后代植株不育性状实施苗期选择；3)应用AFLP标记对上述单株遗传背景实施选择；4)选择分子标记反应为阳性的单株回交；5)重复步骤2)和3)通过3－4代的回交就能获得不育性稳定的青花菜不育系和相应的保持系。本发明首次利用与雄性不育基因紧密连锁的分子标记，以快速培育纯合的雄性不育系。所培育的雄性不育系育性不受温度变化的影响，不育株率、不育度为100％。
文档编号A01H1/04GK101057554SQ200710067888
公开日2007年10月24日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者卢钢, 朱祝军, 邹宜静, 邵泰良, 何勇 申请人:浙江大学