专利名称：利用电子束辐射结合组织培养培育地被菊新品种的方法
技术领域：
本发明涉及培育地被菊新品种的方法，具体地说，涉及一种利用电子束辐射结合组织培养培育地被菊新品种的方法，属于农作物的生物工程育种领域。
背景技术：
菊花(Chrysanthemum×grandiflorum)原产我国，在我国有很长的栽培和应用的历史，是我国的传统名花之一。因其品种丰富，花型花色千变万化，观赏价值高，在世界范围内广泛种植，是世界四大切花之一。
地被菊是菊花在园林应用中适于露地栽培的一个品种群，是以早菊‘美矮粉’(Chrysanthemum‘meiaifen’)等小菊类品种为母本，菊属野生种(含半野生种)毛华菊(C.vestitum)、小红菊(C.chanetii)、甘野菊(C.lavandulifolium)、野菊(C.indicum)、紫花野菊(C.zawadskii)等为父本，进行远缘杂交并连续选择，同时结合辐射育种、芽变选种等手段，培育出的一类全新的菊花品种群。地被菊因其花多而密，花期集中且较长，植株较矮或匍匐状，抗性强，适合露地栽植等特点，在南北园林中被广泛应用。然而大多数品种盛花期都在10月份，并且花期仅为15～20d左右，影响了地被菊的景观效果；花色也多为黄、红、紫、白等颜色，需要进一步的丰富。
利用辐射育种手段从再生苗选育品种是简单有效的育种方法。现有技术中尚未有利用电子束辐射结合通过诱导愈伤及芽再生培育地被菊新品种的方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提供利用电子束辐射结合组织培养培育地被菊新品种的方法，它可以有效地利用地被菊离体培养系统选择突变体，达到创造花色花期新种质的目的。
为了实现本发明目的，本发明的一种利用电子束辐射结合组织培养培育地被菊新品种的方法，其包括如下步骤1)取地被菊的花瓣、花蕾进行剂量20～30Gy电子束辐射，辐射后的花瓣、花蕾切割作为外植体；2)然后在诱导培养基上诱导愈伤组织，愈伤产生芽点后转移到芽分化培养基上增殖，再在生根培养基中诱导生根，最后将试管苗移栽；3)最后采用营养期，花期综合评价筛选新品种。
其中，辐射处理中使用20～30Gy电子束，剂量率为1Gy/min。
本发明所用培养基的配方是，愈伤组织诱导培养基的组成为MS培养基，蔗糖30g/l，琼脂6.0g/l，BAP 2mg/l，NAA 1mg/l，pH5.8～6.0；芽再生培养基的组成为MS培养基，蔗糖30g/l，琼脂6.0g/l，BAP 1mg/l，NAA 0.2mg/l，pH5.8～6.0；生根培养基的组成为1/2 MS培养基。
移栽的基质为草炭和珍珠岩以1∶1重量比混合的基质。
具体地说，本发明的一种利用电子束辐射结合组织培养培育地被菊新品种的方法，包括如下步骤取地被菊的花瓣、花蕾进行剂量20～30Gy电子束辐射，辐射后的花瓣、花蕾切割作为外植体，在组成为MS培养基，蔗糖30g/l，琼脂6.0g/l，BAP 2mg/l，NAA 1mg/l，pH5.8～6.0的诱导培养基上诱导愈伤组织，愈伤产生芽点后转移到组成为MS培养基，蔗糖30g/l，琼脂6.0g/l，BAP 1mg/l，NAA 0.2mg/l，pH5.8～6.0的芽分化培养基上增殖，对诱变处理后的愈伤组织进行恢复培养和扩增，分化芽长到1～2cm时，转入组成为1/2 MS的生根培养基中诱导生根，待生根试管苗长至5cm左右，打开培养瓶盖练苗3～4d，再移栽到草炭和珍珠岩以1∶1重量比混合的基质中，移栽初期注意遮光及水分补充。采用营养期，花期综合评价筛选出突变株，进一步从中选育出新品种。
本发明的方法采用对花瓣、叶片进行辐射处理后通过愈伤诱导及芽分化两步培养法获得再生苗，再从中选择变异株。可为地被菊育种创造了优异材料，并从中选育出新品种。其变异率为5～7％。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实验例采用电子束辐射结合组织培养地被菊筛选花色花期突变体及新品种选育。
1材料与方法1.1材料地被菊品种‘秋韵’花瓣，取盛开期，正常无病虫害的舌状花瓣。地被菊品种‘秋韵’种子购自北京林大林业科技股份有限公司。
1.2外植体的辐射处理用电子束处理外植体，采用4个梯度(0，10Gy，20Gy，30Gy，40Gy)处理，剂量率1Gy/min。
1.3外植体的灭菌外植体在流水中冲洗30～60min，然后在洗涤剂中清洗2次，再次在流水中冲洗10min后，放入70％的酒精浸泡20s，在1％的次氯酸钠灭菌6min，最后用无菌水冲洗3～5次，吸干水分，切成5mm左右的小段，接种到培养基上。
1.4外植体的培养及组培苗的移栽外植体灭菌处理后，接种到愈伤诱导培养基上诱导愈伤，将生长良好的愈伤组织转接到芽再生培养基中诱导丛生芽的再生；分化芽达到2cm时，将之转接到生根培养基(1/2 MS)上诱导生根。待生根试管苗长至5cm左右，打开培养瓶盖练苗3～4d，再移栽到草炭∶珍珠岩＝1∶1的基质中，移栽初期注意遮光及水分补充。
1.5辐射株系的观察在植株盛花期时观察记录辐射株系的株高、叶数、叶宽、花朵数、舌状花长、舌状花宽、花色、花期等性状指标。其中花色按照英国皇家园艺学会色谱标准(Colour Chart，the Royal HorticulturalSociety，London)测定，花期从露蕾到盛花计算。
2.结果与分析2.1培养基成分对愈伤诱导及芽再生的影响花瓣接种到愈伤诱导培养基上4天后，花瓣切口边缘开始皱缩膨大，逐渐转为绿色的愈伤组织。在愈伤组织诱导中，MS+BAP 2mg/l+NAA 1mg/l的效果最好，诱导率可达96.7％，愈伤组织浅绿色，疏松；其次是BAP 4mg/l+NAA 1mg/l，为86.7％，愈伤组织有玻璃化的趋向；而BAP 0.5mg/l+NAA 0.2mg/l诱导率只有45％，诱导产生愈伤组织发黄，质地坚硬；此培养基上大部分外植体没有产生愈伤组织，褐化死亡。
诱导形成的愈伤组织2周后分化出绿色小芽点，并逐渐长出小芽丛，3～5周不定芽开始生长。在不同的培养基上芽再生率也有明显的差异，BAP 1mg/l+NAA 0.2mg/l效果最好，芽再生频率达到86.1％，在此培养基上再生的芽，丛生状，健康粗壮；BAP 4mg/l+NAA 1mg/l组合芽再生效果最差，芽再生频率仅为46.1％，并且再生芽大部分玻璃化，随着培养时间的延长逐渐褐化死亡。
对每块愈伤上再生芽的统计数据可以看出，在BAP 1mg/l+NAA0.2mg/l和BAP 1mg/l+NAA 0.5mg/l两种培养基上，平均芽再生数分别达到5.9和5.4，并且芽生长健壮，有良好的长势；在培养基BAP 4mg/l+NAA 1mg/上，芽再生数仅为1.9。
通过愈伤组织和芽的分化和生长情况的对比观察，为获得最佳培养效果，拟采用三步培养法进行辐射花瓣的培养愈伤诱导阶段采用培养基MS+BAP 2mg/l+NAA 1mg/l，芽再生采用培养基BAP 1mg/l+NAA 0.2mg/l，生根阶段采用1/2 MS。
表1不同培养基成分(BAP和NAA)对愈伤诱导及芽再生的影响
2.2辐射剂量与愈伤诱导率、再生率的关系除了辐照剂量为10Gy时愈伤诱导率与对照没有显著差异外，其余梯度电子束剂量对愈伤诱导有显著的影响。剂量为20Gy时，诱导率下降到51.9％；30Gy时诱导率下降到34.2％，仅为对照诱导率的一半；当剂量达到40Gy时，大部分花瓣不能诱导产生愈伤，随着培养时间的延长，逐渐褐化死亡。20～30Gy是最适于愈伤的诱导及芽再生的剂量。
将外植体形成的愈伤组织转接到芽再生培养基上，辐射转接愈伤组织的芽再生率与对照愈伤组织的芽再生率有显著差别，但是辐射转接愈伤组织的芽再生率之间没有差异。这说明辐射对植物材料的影响主要还是存在于愈伤诱导阶段，一旦愈伤诱导成功后，在合适的芽再生培养基上都可以较高频地实现芽的再生。但是随着剂量的增加，每块愈伤的芽再生数还是存在一定的差异。
表2不同剂量电子束对愈伤诱导及芽再生的影响
2.3辐射剂量与变异率的关系不同剂量电子束对变异率有显著影响，对照处理剂量为0Gy，移栽组陪苗50株，花期性状观察，没有发现变异株，变异率为0。辐照剂量为10Gy时，在150株移栽苗中发现两株变异，变异率为1.3％，两株均为花色变异。此剂量变异率低，与剂量过低，未能在植物细胞内及周围形成有效的能量沉积有直接关系。辐照剂量为20Gy时，变异率最高，达到7％，五株花色变异，两株花期变异，花期比对照后延7～10天。剂量达到30Gy时，出现了两株花色变异株和两株花期的变异株，花期提前10～20天。辐照剂量为40Gy时，变异率反而降低，仅达到3.3％，一株变异株为花色变异。高剂量辐照低变异率说明剂量过高时外植体组织受伤严重，仅有少部分外植体可以形成愈伤组织，进而再生形成芽，低再生率导致了移植株数减少，从而降低了筛选出的变异株数，使变异率降低。综合考虑愈伤诱导率、芽再生率以及变异率，20～30Gy是最佳辐射诱变剂量。
表3不同剂量电子束对变异率及变异性状的影响
2.4辐照植株的形态变异的表现对辐照后植株的多个形态性状进行了测量统计(表4)，结果表明辐照植株株高从20Gy开始辐射剂量对株高有显著影响，植株高度显著降低，这可能与植株辐射损伤有关。同样每个植株花朵数也表现出相同的变化，对照与20Gy的花朵数没有显著差别，当剂量达到20Gy时，花朵数显著降低，40Gy时达到最小值，每株仅有29朵花，仅约为对照花朵数的一半，并且有个别植株花朵不能正常展开，观赏性差。除了株高及花朵数两个指标，辐照植株的其它性状与对照植株没有显著差异。
变异株中出现9个花色变异株，花色按照英国皇家园艺学会色谱标准(Colour Chart，the Royal Horticultural Society，London)测定(表4)；2个花期变异株，可以在8月下旬～10月上旬开花。
表4不同剂量电子束对辐射植株形态的影响
表4辐射处理后花色变化(原始花色为橙-红组，N57B)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种利用电子束辐射结合组织培养培育地被菊新品种的方法，其特征在于，其包括如下步骤1)取地被菊的花瓣、花蕾进行剂量20～30Gy电子束辐射，辐射后的花瓣、花蕾切割作为外植体；2)然后在诱导培养基上诱导愈伤组织，愈伤产生芽点后转移到芽分化培养基上增殖，再在生根培养基中诱导生根，最后将试管苗移栽；3)最后采用营养期，花期综合评价筛选新品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，辐射处理中电子束的剂量率为1Gy/min。
3.根据权利要求1或2所述的法，其特征在于，愈伤组织诱导培养基的组成为MS培养基，蔗糖30g/l，琼脂6.0g/l，BAP 2mg/l，NAA1mg/l，pH 5.8～6.0。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的，其特征在于，芽分化培养基的组成为MS培养基，蔗糖30g/l，琼脂6.0g/l，BAP 1mg/l，NAA0.2mg/l，pH 5.8～6.0。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的，其特征在于，生根培养基的组成为1/2MS培养基。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的，其特征在于，移栽的基质为草炭和珍珠岩以1∶1重量比混合的基质。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的，其特征在于，包括如下步骤取地被菊的花瓣、花蕾进行剂量20～30 Gy电子束辐射，辐射后的花瓣、花蕾切割作为外植体，在组成为MS培养基，蔗糖30g/l，琼脂6.0g/l，BAP 2mg/l，NAA 1mg/l，pH 5.8～6.0的诱导培养基上诱导愈伤组织，愈伤产生芽点后转移到组成为MS培养基，蔗糖30g/l，琼脂6.0g/l，BAP 1mg/l，NAA0.2mg/l，pH 5.8～6.0的芽分化培养基上增殖，对诱变处理后的愈伤组织进行恢复培养和扩增，分化芽长到1～2cm时，转入组成为1/2MS的生根培养基中诱导生根，待生根试管苗长至5cm，打开培养瓶盖练苗3～4d，再移栽到草炭和珍珠岩以1∶1重量比混合的基质中。
全文摘要
本发明提供了一种利用电子束辐射结合组织培养培育地被菊新品种的方法，其包括如下步骤取地被菊的花瓣、花蕾进行剂量20～30Gy电子束辐射，辐射后的花瓣、花蕾切割作为外植体；然后在诱导培养基上诱导愈伤组织，愈伤产生芽点后转移到芽分化培养基上增殖，再在生根培养基中诱导生根，最后将试管苗移栽；最后采用营养期，花期综合评价筛选新品种。可为地被菊育种创造了优异材料，并从中选育出新品种，其变异率可为5～7％。
文档编号A01H4/00GK101015274SQ200710064059
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月16日 优先权日2007年2月16日
发明者张启翔, 孙明, 潘会堂, 程堂仁, 刘华 申请人:北京林业大学