专利名称：性逆转与雌核发育持续生产全雄黄颡鱼方法
技术领域：
性逆转与雌核发育持续生产全雄黄颡鱼方法属于鱼类细胞工程育种领域，特别涉及人工性别控制技术。
背景技术：
正如本申请文件实质审查请求书所提交的附件参考资料[15]所提出的生产单性雄鱼有几种方法可供选择如人工选择、雄性激素直接诱导性逆转、雄核发育、种间杂交、人工诱导三倍体以及遗传学方法等。但因人工挑选的劳动强度大，而且不能准确区分雌雄鱼；用性激素直接诱导性逆转，有性激素残留的危险，许多国家早已禁用。雄核发育则存在诱导率、成活率低以及YY♀生理雌鱼生育力极低等严重的技术障碍，只停留在实验阶段，尚无成功例子。人工诱导三倍体只适用于雄性配子同型的鱼类，而且许多种类难于在商业上应用。只有罗非鱼种间杂交与遗传学方法取得成功，在生产上推广应用。但种间杂交只限于罗非鱼属的几个杂交组合，产卵率较低以及繁殖群体混杂。只有称为GMT的遗传学技术，适用于雄性配子异型的鱼类，方法可靠、稳定，而且对环境无任何不良的影响，可以大量生产全雄鱼。早在上世纪五、六十年代，日本Yamamoto研究青鳉性别决定与伴性遗传时(请阅参考资料17、18、19)，利用雌性激素将XY♂雄鱼逆转成XY♀生理雌鱼，并与XY♂雄鱼交配，首次获得YY♂超雄鱼，证明YY♂超雄鱼是可以存活的，而且还可以雌性化，成为YY♀生理雌鱼，YY♀与YY♂交配便可大量产生YY♂超雄鱼。1980年，我国杨永铨等(请阅参考资料6)应用三系配套途径生产遗传上全雄莫桑比克罗非鱼获得成功，基本就是利用性激素性逆转与后代测交的方法，获得YY♂超雄鱼。1989年，Varadaraj等(请阅参考资料22)也提出类似的方法获得YY♂，超雄莫桑比克罗非鱼；与此同时，Mair等1988年、Baroiller and Jalabert1989年、Scott等1989年(请阅参考资料20、21、8)也相继发表有关研究论文提出相同的方法，获得YY♂超雄尼罗罗非鱼，在这些工作的基础上，Mair等(请阅参考资料的16)1997年发表了规模生产全雄尼罗罗非鱼的育种计划，报道了他们的研究成果，也就是所谓的全雄鱼遗传操作技术(GMT)。这个所谓GMT育种技术是通过五代半的激素性逆转和后代测交最后获得YY♂超雄鱼和YY♀生理雌鱼，并由YY♂超雄鱼和XX♀正常雌鱼生产XY♂全雄鱼。采用这种技术的育种时间较长，而且逐代测交的试验鱼必须严格管理，防止混杂，才能最后取得成功。可见，对于世代周期较长的鱼类而言，就未必是首选的方法，必须采用其他较为有效的技术手段。1989年，Varadaraj等(请阅参考资料22)报道了激素性逆转结合雌核发育技术产生超雄莫桑比克罗非鱼，这种技术据称可将YY♂超雄鱼的产出从25％提高到50％，并可缩短22～8个月的育种时间，还提出商业上大规模生产全雄鱼的方案，但未见在生产上推广应用的报道。至于黄颡鱼的性逆转与雌核发育以及YY♂超雄鱼、XY♂全雄鱼均未见报道。
发明内容
如前所述，目前成功应用于尼罗罗非鱼全雄性种群的生产技术，只有种间杂交或遗传学方法，前者只限于罗非鱼中天然存在的几个杂交组合，不可能应用于其它养殖鱼类，而遗传学方法育种时间过太长(五代半)，不适用于世代周期较长的鱼类，至于印度学者提出激素性逆转结合雌核发育技术，持续生产全雄性莫桑鼻给罗非鱼的技术路线不仅缩短了育种时间22～8个月，并且提高超雄鱼(YY♂)的产出，这是技术上很大的进步，但仍有进一步提高、改进的余地。发明人认为上述技术方案及其技术参数是不适用于黄颡鱼的，必须另行设计。
黄颡鱼是淡水养殖的重要鱼类。在相同的养殖条件下，雄性黄颡鱼比同胞雌鱼的生长速度快30％以上，因此，如能采用适当的性别控制技术，在生产上养殖黄颡鱼雄性群体，用以提高渔产品的质量和产量，具有重大的经济意义与技术价值。发明人分析国内外鱼类性别控制的技术经验，提出采用雌核发育结合激素性逆转的集成技术，这就是本发明所要解决的技术，以此达到建立超雄黄颡鱼和全雄鱼黄颡鱼的繁育体系的目的。
为此，本发明采用的技术方案如下(1)人工催产选择体表无伤、腹部膨大柔软、性腺发育良好的雌鱼及性成熟的雄鱼用绒毛膜促性腺激素和鱼用促排卵素进行人工催产，在每条鱼胸鳍基部一次性注射，催产剂的使用剂量雌鱼为绒毛膜促性腺激素800IU，鱼用排卵素10μg，雄鱼为绒毛膜促性激素400IU，鱼用排卵素5μg；置于水温26℃中，24小时后从雄鱼体中挤出精液或剖腹取精，从雌鱼挤出成熟的卵子进行人工授精；对长吻鮠雄鱼剂量加倍；
(2)激素性逆转用卤虫幼体作为激素载体，预先在50～300μg/L的乙炔基雌二醇浸泡一个小时，然后抽滤取出卤虫作为活饵料投喂开口摄食4天的黄颡鱼正常鱼苗XX♀；XY♂，每天早、中、晚上各投喂一次，投喂量以30分钟内吃完为准，连续喂养40天；(3)性逆转的XY♀生理雌鱼的雌核发育(3.1)精子灭活，选用长吻鮠雄鱼精子激活黄颡鱼卵雌核发育，从激素催情后的长吻鮠雄鱼剖腹取出精巢，用剪刀剪碎，加6-8倍的Hank’s液稀释过滤至Φ9cm的培养皿中，精液厚度2-3mm，然后置于转速115转/分的冰浴摇床上摇动。用一支波长253730W紫外灯管照射，照距35cm，照射强度为1×764μw/cm2，并随时取少量精液在解剖镜下观察精子活动情况，一般照射30分钟即可。当精子被水激活后大部分还能缓慢泳动时，即可停止照射；(3.2)雌核二倍体获得，将XY♀黄颡鱼生理雌鱼人工催产获得的成熟鱼卵，与长吻鮠灭活的精子进行人工授精，授精后1-10分钟内，用0-5℃冰水处理5～20分钟，阻断减数分裂第二极体排出，恢复雌核二倍体，取出置于26℃的恒温培养箱中孵化，便可获得候选的YY♂超雄黄颡鱼和XX♀雌鱼。
(4)候选YY♂超雄黄颡鱼的后代测交，从后代雌雄性比推断候选雄鱼的基因型是YY或XX，取性成熟候选YY♂超雄黄颡鱼与XX♀正常雌鱼测交，按Mair等制定的尼罗罗非鱼标准，用K.Pearson氏X2检验法，测定其后代性比的观察值和理论值的符合度；当符合几率P＞0.05时，则为XY型；当P＜0.001时，则为YY或XX型；以推断经后代性比测交的供试鱼基因型为XY或YY或XX，从而挑选出确认的YY♂超雄黄颡鱼；(5)全雄黄颡鱼持续生产，将经后代测交确认的YY♂超雄黄颡鱼与正常XX♀雌鱼交配，即得XY♂全雄黄颡鱼；将经后代测交确认的YY♂超雄黄颡鱼与性逆转超雄生理雌鱼交配，即得全YY♂超雄黄颡鱼。
本发明的有益效果是(1)由于性逆转与雌核发育相结合集成技术的创建，形成了持续生产YY♂超雄黄颡鱼与XY♂全雄黄颡鱼的繁育体系，并为黄颡鱼及其他雄性配子异型的鱼类性别控制提供一条新的技术途径。
(2)缩短了育种时间，与遗传学技术(GMT)相比较，可以缩短两代，即24个月，比Varadaraj等技术缩短了半代，即6个月，提高了工效。三种技术路线比较如附表所示。
(3)有明显的经济与社会效益，实验证明本技术实施方案成活率和性逆转的比例以及超雄鱼的产出均达到了设计指标；基本上解决了全雄性黄颡鱼的单性种群的生产问题，在不增加人工、饲料成本的情况下，可以提高单产25％以上；全雄性黄颡鱼种苗价格与混性种苗相比较可提高25～30％。
图1性逆转与雌核发育持续生产全雄黄颡鱼方法技术原理图。
图2性逆转与雌核发育持续生产全雄黄颡鱼方法流程图。
附表三种技术方案工艺过程比较。
具体实施例方式
实施本发明的方式可参照图2进行。其具体工艺流程如下(1)人工催产，可按常规进行，即选择体表无伤、腹部膨大柔软、性腺发育良好的雌鱼及性成熟的雄鱼用绒毛膜促性腺激素和鱼用促排卵素进行人工催产，在每条鱼胸鳍基部一次性注射，催产剂的使用剂量雌鱼为绒毛膜促性腺激素800IU，鱼用排卵素2号10μg。雄鱼剂量减半。即400IU、5μg绒毛膜促性腺激素和鱼用排卵素2号为杭州动物药品厂和萧山第一兽药制造有限公司联合生产的产品。将之置于水温26℃中，24小时后从雄鱼体中挤出精液或剖腹取精，从雌鱼挤出成熟的卵子进行人工授精。对于长吻鮠雄鱼剂量加倍。
(2)激素性逆转，用卤虫幼体作为激素载体，将之置于50～300μg/L的17-乙炔基雌二醇(EE2)中浸泡1小时，然后抽滤取出卤虫作为活饵料投喂开口摄食4天的黄颡鱼正常鱼苖(XX♀；XY♂)，每天早、中、晚各投喂一次，投喂量以30分钟内吃完为准，连续喂养40天，实验结果证明成活率在60％以上，转化率在95％以上，XY♀生理雌鱼约50％。
(3)性逆转的XY♀生理雌鱼雌核发育，本工艺过程包括以下两个步骤第一，精子灭活，选用长吻鮠雄鱼精子激活黄颡鱼卵雌核发育，从激素催情后的长吻鮠雄鱼剖腹取出精巢，用剪刀剪碎。加6-8倍的Hank’s液稀释过滤至φ9cm的培养皿中，精液厚度2-3mm，然后置于转速115转/分的冰浴摇床上摇动。再用一支波长253730W紫外灯管照射，照距35cm，照射强度为1×764μw/cm2，并随时取少量精液在解剖镜下观察精子活动情况，一般照射30分钟即可。当精子被水激活后大部分还能缓慢泳动时，即可停止照射。
第二，雌核二倍体获得，将XY♀黄颡鱼生理雌鱼人工催产获得的成熟鱼卵，与长吻鮠灭活的精子进行人工授精，授精后1-10分钟内，用0-5℃冰水处理5～20分钟，阻断减数分裂第二极体排出，恢复雌核二倍体，取出置于26℃的恒温培养箱中孵化，便可获得候选的YY♂超雄黄颡鱼和XX♀雌鱼。
(4)候选YY♂超雄黄颡鱼的后代测交，从后代雌雄性比推断候选雄鱼的基因型是YY或XX。取性成熟候选YY♂超雄黄颡鱼与XX♀正常雌鱼测交，按Mair等制定的尼罗罗非鱼标准，用K.Pearson氏X2检验法(chi squaretest)测定其后代性比的观察值和理论值的符合度，雄性配子异型的鱼类(XY♂)其后代雌雄比各为50％，这是性比的理论值。当观察值与理论值越接近时，则X2值越小；反之，X2越大。而符合几率P与X2值成反比，即X2越大，相符则观察值与理论值不相符。反之X2越小，P值越高，观察值越与理论值相符。当P＞0.05时，则为XY型，当P＜0.001时，则为YY或XX型，以推断经后代性比测交的供试鱼基因型为XY或YY或XX，从而挑选出确认的YY♂超雄黄颡鱼；(5)全雄黄颡鱼持续生产，将侯选的经后代测交确认的YY♂超雄黄颡鱼与正常XX♀雌鱼交配，即得XY♂全雄黄颡鱼；将经后代测交确认的YY♂超雄黄颡鱼与性逆转超雄生理雌鱼交配，经验证即得YY♂超雄黄颡鱼。
至此，即形成了持续生产全雄和超雄黄颡鱼的生产过程以及它们的繁育体系。
权利要求
一种性逆转与雌核发育持续生产全雄黄颡鱼方法，它包括性逆转与雌核发育，其特征是按以下工序进行1人工催产选择体表无伤、腹部膨大柔软、性腺发育良好的雌鱼及性成熟的雄鱼用绒毛膜促性腺激素和鱼用促排卵素进行人工催产，在每条鱼胸鳍基部一次性注射，催产剂使用剂量雌鱼为绒毛膜促性腺激素800IU，鱼用排卵素10μg，雄鱼为绒毛膜促性激素400IU，鱼用排卵素5μg；置于水温26℃中，24小时后从雄鱼体中挤出精液或剖腹取精，从雌鱼挤出成熟的卵子进行人工授精；对长吻鮠雄鱼剂量加倍；
2激素性逆转用卤虫幼体作为激素载体，预先在50～300μg/L的乙炔基雌二醇浸泡一个小时，然后抽滤取出卤虫作为活饵料投喂开口摄食4天的黄颡鱼正常鱼苗XX♀；XY♂，每天早、中、晚上各投喂一次，投喂量以30分钟内吃完为准，连续喂养40天；
3性逆转的XY♀生理雌鱼的雌核发育3.1精子灭活，选用长吻鮠雄鱼精子激活黄颡鱼卵雌核发育，从激素催情后的长吻鮠雄鱼剖腹取出精巢，用剪刀剪碎，加6-8倍的Hank’s液稀释过滤至Φ9cm的培养皿中，精液厚度2-3mm，然后置于转速115转/分的冰浴摇床上摇动；用一支波长253730W紫外灯管照射，照距35cm，照射强度为1×764μw/cm2；并随时取少量精液在解剖镜下观察精子活动情况，一般照射30分钟即可；当精子被水激活后大部分还能缓慢泳动时，即停止照射；3.2雌核二倍体获得，将XY♀黄颡鱼生理雌鱼人工催产获得的成熟鱼卵，与长吻鮠灭活的精子进行人工授精，授精后1-10分钟内，用0-5℃冰水处理5～20分钟，阻断减数分裂第二极体排出，恢复雌核二倍体，取出置于26℃的恒温培养箱中孵化，便可获得候选的YY♂超雄黄颡鱼和XX♀雌鱼；
4候选YY♂超雄黄颡鱼的后代测交，从后代雌雄性比推断候选雄鱼的基因型是YY或XX，取性成熟候选YY♂超雄黄颡鱼与XX♀正常雌鱼测交，按Mair等制定的尼罗罗非鱼标准，用K.Pearson氏X2检验法，测定其后代性比的观察值和理论值的符合度；当符合几率P＞0.05时，则为XY型；当P＜0.001时，则为YY或XX型；以推断经后代性比测交的供试鱼基因型为XY或YY或XX，从而挑选出确认的YY♂超雄黄颡鱼；
5全雄黄颡鱼持续生产，将经后代测交确认的YY♂超雄黄颡鱼与正常XX♀雌鱼交配，即得XY♂全雄黄颡鱼；将经后代测交确认的YY♂超雄黄颡鱼与性逆转超雄生理雌鱼交配，即得YY♂超雄黄颡鱼。
全文摘要
性逆转与雌核发育持续生产全雄黄颡鱼方法属鱼類细胞工程育种，特别涉及人工性别控制技术。它需解决的技术问题是将雌核发育与激素性逆转相结合用于黄颡鱼性别的控制，使之成为全雄黄颡鱼。技术方案如下人工催产对性成熟的雌鱼及雄鱼进行人工催产；人工授精；激素性逆转用含有激素的卤虫幼体喂养黄颡鱼鱼苗，使雄性转化为生理雌鱼；性逆转生理雌鱼的雌核发育它包括精子灭活和雌核二倍体获得过程，产生候选超雄鱼和正常雌鱼；经后代测交确认的超雄鱼与正常雌鱼交配获得全雄鱼，超雄鱼性逆转生理雌鱼再与超雄鱼交配，得全超雄黄颡鱼，从而构成全雄鱼和超雄鱼生产工艺。形成全雄黄颡鱼的繁育体系，适用于全雄黄颡鱼的生产。
文档编号A01K67/027GK1994072SQ200610166518
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月28日 优先权日2006年12月28日
发明者陈宏溪, 刘汉勤 申请人:中国科学院水生生物研究所