专利名称：嵌合动物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的方法，具体是一种嵌合动物的制备方法。
背景技术：
抗体是一种可以高度专一地识别和结合抗原物质的一种蛋白质，是动物抵御和清除外源病原体和内源变异细胞的屏障。抗体作为疾病预防、诊断和治疗药物在临床使用已有上百年的发展历史，如中华人民共和国药典2005年版(三部)收录的基于特异抗体的药物制剂有白喉抗毒素、破伤风抗毒素、多价气性坏疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇血清、抗炭疽血清和抗狂犬病血清等，这些抗体是通过超免疫注射马匹获得高效价抗血清，经胃酶消化、盐析提纯、冻干后制成，有效成分为马抗体的(Fab)2部分，作为异源蛋白马抗体的(Fab)2注射给人体时易于引起过敏反应，危害患者生命，因此，发展对人体没有免疫反应的人抗体生产技术具有重大的意义。
经对现有技术的文献检索发现，Tomizuka等在《Nature Genetics》(《自然遗传学》，1997年16卷133页)上发表了题为“Functional expression and germlinetransmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice”(“一段人染色体片断在崁合小鼠功能表达和在种系细胞中遗传”)的论文提出如下技术方案将含人免疫球蛋白基因组座位的染色体片断通过分子生物学技术转入小鼠，同时对小鼠本身的内源免疫球蛋白基因组座位(locus)进行遗传学操作进行沉默，这样的转染色体小鼠从功能上能够重组免疫球蛋白序列单元，表达各种人抗体。再用常规动物免疫，即可达到小鼠生产的人抗体。但在这种转染色体小鼠技术方案中，由于抗体基因组十分冗长、其产生及调节极为复杂，操作过程极其复杂、周期长、成功率低、难于普及应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种嵌合动物的制备方法，使其简便易行、成本低、易成功、周期短、可在短时间内生产多种类型抗体。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括下列步骤
①准备新鲜的人脐血细胞首先在无菌条件下用20ml的注射器抽吸断脐后靠胎盘侧的脐血(10-20ml)，然后将脐血在室温下转运至实验室，每个小鼠胚胎需要注射100-200ul新鲜的人脐血细胞，不需要将人脐血干细胞进行分离、纯化；②注射于早期的动物胚胎囊腔内在无菌操作下，用注射器将100-200ul新鲜的人脐血细胞混悬液(上述转运至实验室的脐血)注射于早期小鼠胚胎囊腔内，同时应避免损伤动物胚胎；③使注射后的早期小鼠胚胎继续发育至新生动物，最后发育至成年小鼠对孕有注射后胚胎的小鼠进行饲养，并密切观查，直至生出小鼠后代，然后使该小鼠后代发育为成年小鼠。
本发明的操作简单在无菌条件下，用注射器将新鲜的人脐血细胞注射于9-11天大小的小鼠胚胎囊腔内，注射后的胚胎继续发育至新生小鼠，最后发育至成年小鼠。用免疫方法和聚合酶链式反应技术测定显示，在胚胎囊腔中注射人细胞的成年小鼠血液中存在成熟的人抗体，以及分泌人抗体的免疫细胞，一旦准备出能够产生人抗体的小鼠，本领域的科研人员就可以用传统的动物免疫技术免疫能够产生人抗体的小鼠生产多克隆抗体，用B-细胞与骨髓瘤细胞融合技术制备单克隆抗体。
本发明的操作在大动物，如马、牛、猪，羊上更容易操作，因为这些大动物的胚胎体积相对较大，更容易准确将人细胞注射到胚胎囊腔内，甚至胚胎囊腔中更精确的位置，从而准备出可以产生人抗体的大动物。在获得本发明含人细胞崁合动物的基础上，本领域的科技人员就能够常规的动物免疫方法用各种抗原对含人细胞崁合动物进行免疫大规模制备抗原特异的人多克隆抗体；还可以利用常规的细胞融合技术，准备人单克隆抗体。这些人抗体可以用于对人类疾病的预防和治疗，避免动物抗体给人体带来的过敏和副作用，促进人抗体药物的开发。
本发明的制备方法具有下述优点简便易行、成本低、易成功、周期短、能够大规模制备特异的人源多克隆抗体，克服鼠源抗体人源化不足以及转基因动物操作复杂的困难，促进人源单克隆抗体药物的开发。(1)能够大规模制备特异的人多克隆抗体，一方面避免直接用抗原免疫人体带来的不适、副作用和潜在安全等风险，另一方面克服动物抗体带来的过敏和不能满足部分过敏体质人群的缺点；(2)能够制备人源多克隆抗体，克服鼠源抗体人源化不足，以及转基因动物操作复杂的困难，促进人源单克隆抗体药物的开发。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如张龙翔、张庭芳、李令媛等人在《生化实验方法和技术(第二版)》(北京高等教育出版社，2001)和JohnM.Walker等人在《Theproteinprotocolshandbook(secondedition)》(《蛋白质实验手册(第二版)》)，totowa，NewJersey，HumanaPress，2002)中所述的条件。
实施例1小鼠1的操作过程在无菌条件下用20ml的注射器抽吸断脐后靠胎盘侧的脐血(10-20ml)，然后将脐血在室温下转运至实验室，在无菌条件下，将上述从医院转运至实验室的脐血倒入60平方毫米大小的平皿，用注射器直接从平皿中抽取100-200ul新鲜的人脐血细胞混悬液(来自上海市第五医院)注射于9天大小的小鼠胚胎(C57BL/6与昆明小鼠杂交后的胚胎)的囊腔内，并让此胚胎继续发育至新生小鼠，最后发育至成年小鼠，标记为实验小鼠1。
免疫荧光组织化学鉴定从成年实验小鼠1和未经过任何操作的小鼠(阴性对照)的尾中各取一滴血滴在载玻片上，做成血涂片，分别编号，用甲醇固定5分钟，用PBS缓冲液(pH7.2～7.4，含NaCl 137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L)漂洗3次，用0.1％的胰蛋白酶(100ml0.1mg胰蛋白酶，含0.1％氯化钙)于37℃消化20分钟，再经PBS漂洗3次后，用1∶10的山羊血清于37℃封闭血涂片10分钟；最后进行荧光抗体染色(1)滴加MouseAnti-HumanIgG(鼠抗人IgG)(γchainspecific，1∶10稀释)第一抗体，于4℃湿盒内孵育过夜，然后用PBS充分冲洗；(2)在血涂片上滴加山羊抗鼠lgG-FITC(1∶100稀释)第二抗体，于37℃湿盒中孵育30分钟，然后用PBS漂洗；(3)滴加DAPI(1∶10000稀释)，于37℃湿盒中孵育20分钟，用PBS漂洗、晾干、封片，用荧光显微镜进行观察。结果显示实验小鼠1出现特异性阳性信号，阴性对照小鼠未出特异性信号。
人抗体蛋白水平鉴定剪小鼠尾，取一滴血，接入1.5毫升塑料离心管中，超声破碎，用含0.9％NaCl的磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.2)进行稀释至1/2、1/4和1/16，分别取0.5μl，点在硝酸纤维素膜上，空气中凉干。用空白小鼠血液样品作阴性对照，人血液样品作阳性对照，经过3％牛血清白蛋白封闭，与抗人IgG抗体的小鼠抗体-辣根过氧化酶(HRP，1∶16)孵育，DAB底物显色，结果实验小鼠1在1/2、1/4两个稀释浓度，阳性对照都出现阳性信号，空白小鼠未出信号。
人抗体K链基因鉴定针对人的抗体的K链基因设计聚合酶链式反应引物IgGLKf-r上游引物5’-gtggctgcaccatctgtcttcatc-3’，下游引物5’-ctaacactctcccctgtt-3’；聚合酶链式反应反应体系(50μL)为10×superTaq缓冲液III10μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，superTaq酶(5U/μL)(申能博采，上海)0.5μL，重蒸水32μL；聚合酶链式反应反应条件为94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，40个循环，最后循环为95℃1min，55℃1min，72℃延伸10min。聚合酶链式反应产物用凝胶电泳检测，实验结果显示混合人血的空白小鼠血液样品，以及实验小鼠1血液样品都扩增出了长度为315bp的目标条带，而空白小鼠血液样品未扩增出目标条带。
人抗体重链基因鉴定针对人的抗体重链基因设计引物，目标条带长度127bp，上游引物5’-gactccgacggctccttcttcc-3’，下游引物5’-ggctcttctgcgtgtagtggttgt-3’；聚合酶链式反应反应体系(50μL)为10×Taq聚合酶缓冲液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，Taq酶(5U/μL)(赛百盛，上海)0.5μL，重蒸水37μL；聚合酶链式反应反应条件为94℃3min，94℃0.5min，58℃0.5min，72℃0.5min，40个循环，最后循环为95℃0.5min，58℃0.5min，72℃延伸10min。聚合酶链式反应产物用凝胶电泳检测，实验结果显示在人血DNA样品，含1％人血的空白小鼠血液样品，以及实验小鼠1血液样品都扩增出了长度为127bp的目标条带，而空白小鼠血液样品未扩增出目标条带。
实施例2小鼠2的操作过程在无菌条件下用20ml的注射器抽吸断脐后靠胎盘侧的脐血(10-20ml)，然后将脐血在室温下转运至实验室，在无菌条件下，将上述从医院转运至实验室的脐血倒入60平方毫米大小的平皿，用注射器直接从平皿中抽取100-200ul新鲜的人脐血细胞混悬液(来自上海市第五医院)注射于11天大小的小鼠胚胎(C57BL/6与昆明小鼠杂交后的胚胎)的囊腔内，并让此胚胎继续发育至新生小鼠，最后发育至成年小鼠，标为实验小鼠2。
免疫荧光组织化学鉴定从成年实验小鼠2和未经过任何操作的小鼠(阴性对照)的尾中各取一滴血滴在载玻片上，做成血涂片，分别编号，用甲醇固定5分钟，用用PBS缓冲液(pH7.2～7.4，含NaCl137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L)漂洗3次，用0.1％的胰蛋白酶(100ml0.1mg胰蛋白酶，含0.1％氯化钙)于37℃消化20分钟，再经PBS漂洗3次后，用1∶10的山羊血清于37℃封闭血涂片10分钟，最后进行荧光抗体染色(1)滴加MouseAnti-HumanIgG(鼠抗人IgG)(γchainspecific，1∶10稀释)第一抗体，于4℃湿盒内孵育过夜，然后用PBS充分冲洗；(2)在血涂片上滴加山羊抗鼠lgG-FITC(1∶100稀释)第二抗体，于37℃湿盒中孵育30分钟，然后用PBS漂洗；(3)滴加DAPI(4’，6-diamidino-2-phenylindole，4’，6-二眯基-2-苯基吲哚)(1∶10000稀释)，于37℃湿盒中孵育20分钟，用PBS漂洗、晾干、封片，用荧光显微镜进行观察。结果显示实验小鼠2出现特异性阳性信号，阴性对照小鼠未出特异性信号。
人抗体蛋白水平鉴定剪小鼠尾，取一滴血，接入1.5毫升塑料离心管中，超声破碎，用含0.9％NaCl的磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.2)进行稀释至1/2、1/4、1/16，分别取0.5μl，点在硝酸纤维素膜上，空气中凉干；用空白小鼠血液样品作阴性对照，人血液样品作阳性对照，经过3％牛血清白蛋白封闭，与抗人IgG抗体的小鼠抗体-辣根过氧化酶(HRP，1∶16)孵育，DAB底物显色，结果实验小鼠2在1/2，1/4两个稀释浓度，阳性对照都出现阳性信号，空白小鼠未出信号。
人抗体K链基因鉴定针对人的抗体的K链基因设计聚合酶链式反应引物IgGLKf-r上游引物5’-gtggctgcaccatctgtcttcatc-3’，下游引物5’-ctaacactctcccctgtt-3’；聚合酶链式反应反应体系(50μL)为10xsuperTaq聚合酶缓冲液bufferIII10μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，superTaq酶(5U/μL)(申能博采，上海)0.5μL，重蒸水32μL；聚合酶链式反应反应条件为94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，40个循环，最后循环为95℃1min，55℃1min，72℃延伸10min。聚合酶链式反应产物用凝胶电泳检测，实验结果显示人血的空白小鼠血液样品，以及实验小鼠2血液样品都扩增出了长度为315bp的目标条带，而空白小鼠血液样品未扩增出目标条带。
人抗体重链基因鉴定针对人的抗体重链基因设计引物，目标条带长度127bp，上游引物5’-gactccgacggctccttcttcc-3’，下游引物5’-ggctcttctgcgtgtagtggttgt-3’，聚合酶链式反应反应体系(50μL)为10xTaq聚合酶缓冲液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，Taq酶(5U/μL)(赛百盛，上海)0.5μL，重蒸水37μL，聚合酶链式反应反应条件为94℃3min，94℃0.5min，58℃0.5min，72℃0.5min，40个循环，最后循环为95℃0.5min，58℃0.5min，72℃延伸10min。聚合酶链式反应产物用凝胶电泳检测，实验结果显示在人血DNA样品，含1％人血的空白小鼠血液样品，以及实验小鼠2血液样品都扩增出了长度为127bp的目标条带，而空白小鼠血液样品未扩增出目标条带。
实施例3操作过程在无菌条件下用20ml的注射器抽吸断脐后靠胎盘侧的脐血(10-20ml)，然后将脐血在室温下转运至实验室，在无菌条件下，将上述从医院转运至实验室的脐血倒入60平方毫米大小的平皿，用注射器直接从平皿中抽取100-200ul新鲜的人脐血细胞(来自上海市第五医院)注射于10天大小的小鼠胚胎(C57BL/6与昆明小鼠杂交后的胚胎)的囊腔内，并让此胚胎继续发育至新生小鼠，最后发育至成年小鼠，标为实验小鼠3。
免疫荧光组织化学鉴定从成年实验小鼠3和未经过任何操作的小鼠(阴性对照)的尾中各取一滴血滴在载玻片上，做成血涂片，分别编号，用甲醇固定5分钟，用用PBS缓冲液(pH7.2～7.4，含NaCl137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L)漂洗3次，用0.1％的胰蛋白酶(100ml0.1mg胰蛋白酶，含0.1％氯化钙)于37℃消化20分钟，再经PBS漂洗3次后，用1∶10的山羊血清于37℃封闭血涂片10分钟，最后进行荧光抗体染色(1)滴加MouseAnti-HumanIgG(鼠抗人IgG)(γchainspecific，1∶10稀释)第一抗体，于4℃湿盒内孵育过夜。然后用PBS充分冲洗；(2)在血涂片上滴加山羊抗鼠lgG-FITC(1∶100稀释)第二抗体，于37℃湿盒中孵育30分钟，然后用PBS漂洗；(3)滴加DAPI(1∶10000稀释)，于37℃湿盒中孵育20分钟，用PBS漂洗、晾干、封片，用荧光显微镜进行观察。结果显示实验小鼠3出现特异性阳性信号，阴性对照小鼠未出特异性信号。
人抗体蛋白水平鉴定剪小鼠尾，取一滴血，接入1.5毫升塑料离心管中，超声破碎，用含0.9％NaCl的磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.2)稀释至1/2、1/4、1/16，分别取0.5μl，点在硝酸纤维素膜上，空气中凉干。用空白小鼠血液样品作阴性对照，人血液样品作阳性对照，经过3％牛血清白蛋白封闭，与抗人IgG抗体的小鼠抗体-辣根过氧化酶(HRP，1∶16)孵育，DAB底物显色，结果实验小鼠3在1/2，1/4两个稀释浓度，阳性对照都出现阳性信号，空白小鼠未出信号。
人抗体K链基因鉴定针对人的抗体的K链基因设计聚合酶链式反应引物IgGLKf-r上游引物5’-gtggctgcaccatctgtcttcatc-3’，下游引物5’-ctaacactctcccctgtt-3’；聚合酶链式反应反应体系(50μL)为10xsuperTaq聚合酶缓冲液III10μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，superTaq酶(5U/μL)(申能博采，上海)0.5μL，重蒸水32μL；聚合酶链式反应反应条件为94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，40个循环，最后循环为95℃1min，55℃1min，72℃延伸10min，聚合酶链式反应产物用凝胶电泳检测，实验结果显示混合人血的空白小鼠血液样品，以及实验小鼠3血液样品都扩增出了长度为315bp的目标条带，而空白小鼠血液样品未扩增出目标条带。
人抗体重链基因鉴定针对人的抗体重链基因设计引物，目标条带长度127bp，上游引物5’-gactccgacggctccttcttcc-3’，下游引物5’-ggctcttctgcgtgtagtggttgt-3’。聚合酶链式反应反应体系(50μL)为10xTaq聚合酶缓冲液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，Taq酶(5U/μL)(赛百盛，上海)0.5μL，重蒸水37μL；聚合酶链式反应反应条件为94℃3min，94℃0.5min，58℃0.5min，72℃0.5min，40个循环，最后循环为95℃0.5min，58℃0.5min，72℃延伸10min。聚合酶链式反应产物用凝胶电泳检测，实验结果显示在人血DNA样品，含1％人血的空白小鼠血液样品，以及实验小鼠3血液样品都扩增出了长度为127bp的目标条带，而空白小鼠血液样品未扩增出目标条带。
权利要求
1.一种嵌合动物的制备方法，其特征在于，具体步骤包括①准备新鲜的人脐血细胞首先在无菌条件下用注射器抽吸断脐后靠胎盘侧的脐血，然后将脐血在室温下转运至实验室；②注射于早期的动物胚胎囊腔内在无菌条件下，用注射器将上述转运至实验室的脐血注射于早期小鼠胚胎囊腔内；③使注射后的早期小鼠胚胎继续发育至新生动物，最后发育至成年小鼠对孕有注射后胚胎的小鼠进行饲养，直至生出小鼠后代，然后使该小鼠后代发育为成年小鼠。
2.根据权利要求1所述的嵌合动物的制备方法，其特征是，步骤①中，所述的以注射器抽吸断脐后靠胎盘侧的脐血，抽吸的体积为10-20ml。
3.根据权利要求1所述的嵌合动物的制备方法，其特征是，步骤②中，所述的用注射器将上述转运至实验室的脐血注射于早期小鼠胚胎囊腔内，注射的脐血为100-200ul。
4.根据权利要求1所述的嵌合动物的制备方法，其特征是，步骤②中，所述的早期小鼠胚胎，是指9-11天大小的小鼠胚胎。
全文摘要
一种嵌合动物的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明方法具体步骤包括①准备新鲜的人脐血细胞首先在无菌条件下用注射器抽吸断脐后靠胎盘侧的脐血，然后将脐血在室温下转运至实验室；②注射于早期的动物胚胎囊腔内在无菌条件下，用注射器将上述转运至实验室的脐血注射于早期小鼠胚胎囊腔内；③使注射后的早期小鼠胚胎继续发育至新生动物，最后发育至成年小鼠对孕有注射后胚胎的小鼠进行饲养，直至生出小鼠后代，然后使该小鼠后代发育为成年小鼠。本发明方法简便易行、成本低、易成功、周期短、能够大规模制备特异的人源多克隆抗体，可克服鼠源抗体人源化不足以及转基因动物操作复杂的困难，促进人源单克隆抗体药物的开发。
文档编号A01K67/027GK1994073SQ20061014822
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月28日 优先权日2006年12月28日
发明者吴际, 李荣秀 申请人:上海交通大学