专利名称：利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法。
背景技术：
家蚕是一种重要的经济和模式生物，为我国社会主义经济的发展做出了巨大贡献并正在为中国经济可持续发展进一步做着更大的贡献。由中国家蚕基因组计划研究小组领导的家蚕基因组框架图的率先完成，不但确立了我国家蚕功能基因组研究在国际上的地位，而且也为蚕丝业和昆虫学科的发展提供了新的契机。功能基因组时期的主要工作包括主要功能基因的鉴定克隆，重要生物学性状的分子机理的阐明，最终实现重要经济性状的人为调节和创造。家蚕最重要的性状是家蚕丝腺能在短时间高效地大量合成绢丝蛋白。利用家蚕丝腺的这一特点，在丝腺中高效表达外源蛋白一直是许多蚕学和生物学科技工作者追求的目标。目前，这项工作主要瓶颈是转基因技术的突破和转基因蚕中被表达的外源蛋白在丝心蛋白中的比例含量低。解决这些制约学科研究发展的瓶颈，是创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，拓宽家蚕的应用领域，保持蚕丝产业可持续发展，促进我国蚕学和昆虫学科的长远发展的重要基础工作。
利用鳞翅目来源的转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术最初在日本取得成功，但该技术在我国一直没有获得实质性突破，成为制约我国该学科研究发展的瓶颈。目前，本发明申请人已经建立了系统而完善的家蚕胚胎显微注射转基因技术并取得成功，为本研究的工作开展打下了良好的基础。最近，在国外，在转基因家蚕丝腺里生产外源蛋白曾被报道。然而，由于转基因家蚕茧的主要成分仍然是家蚕本身的蚕丝蛋白，而这些家蚕表达系统是分别利用家蚕丝心蛋白的两个非主要的成分——轻链和fibrohexamerin/P25的启动子，故这些家蚕表达系统不是很有效的外源蛋白的表达系统。
普通家蚕茧的主要组成是蚕丝丝心蛋白(fibroin)和丝胶(sericin)，其中丝心蛋白是茧的主要成分，约占茧层重的82％。蚕丝丝心蛋白由家蚕的后部丝腺(PSG)细胞合成，丝胶由中部丝腺细胞合成，它们都在中部丝腺聚集，最后经过前部丝腺被榨丝后而吐丝结茧。丝心蛋白由350-kDa的重链蛋白(H-chain)，26-kDa的轻链蛋白(L-chain)和30-kDafibrohexamerin/P25(fhx)三种蛋白构成。这些蛋白在后部丝腺细胞内首先按照一定的比例(H-chain∶L-chain∶fhx＝6∶6∶1)形成丝心蛋白基本单位，然后丝心蛋白基本单位被分泌到腺腔。在丝心蛋白基本单位中重链蛋白是最主要的成分，达92％，而轻链蛋白只占约7％，fhx约占1％。最近报道的在转基因家蚕丝腺里产生外源蛋白都是利用轻链蛋白和fhx启动子，这些家蚕表达系统不能很有效的表达外源蛋白是由于这两个组分本来就是丝心蛋白的两个非主要的成分。家蚕丝心蛋白最主要成分——重链蛋白启动子的开发将有助于较大幅度地提高转基因家蚕茧中外源重组蛋白的比例，而且在利用鳞翅目来源的转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术的研究报道中，有关利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法。该方法突破转基因蚕中被表达的外源蛋白在丝心蛋白中的含量低的难点，首次开发和利用家蚕丝心蛋白重链启动子，使家蚕丝腺生物反应器向人为控制的方向发展。
本发明将家蚕胚胎显微注射技术，荧光检测与分子生物操作技术相结合，构建了一个在家蚕丝腺中特异高效表达的家蚕丝心蛋白重链启动子，简称为Fib-HP3，长度为2304bp，其核酸序列是aagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatattttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaagtattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatcacgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatgatcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagCATCAGTTCGGTTCCAACTCTCAAGATGAGAGTCAAAACCTTTGTGATCTTGTGCTGCGCTCTGCAGgtgagttaattattttactattatttcagaaggtggccagacgatatcacgggccacctgataataagtggtcgccaaaacgcacagatatcgtaaattgtgccatttgatttgtcacgcccgggggggctacggaataaactacatttatttatttaaaaaatgaaccttagattatgtaacttgtgatttatttgcgtcaaaagtaggcaagatgaatctatgtaaatacctgggcagacttgcaatatcctatttcaccggtaaatcagcattgcaatatgcaatgcatattcaacaatatgtaaaacaattcgtaaagcatcattagaaaatagacgaaagaaattgcataaaattataaccgcattattaatttattatgatatctattaacaattgctattgcctttttttcgcaaattataatcattttcataacctcgaggtagcattctgttacattttaatacattgg
tatgtgattataacacgagctgcccactgagtttctcgccagatcttctcagtgggtcgcgttaccgatcacgtgatagattctatgaagcactgctcttgttagggctagtgttagcaaattctttcaggttgagtctgagagctcacctacccatcggagcgtagctggaataggctaccagctaataggtagggaaaacaaagctcgaaacaagctcaagtaataacaacataatgtgaccataaaatctcgtggtgtatgagatacaattatgtactttcccacaaatgtttacataattagaatgttgttcaacttgcctaacgccccagctagaacattcaattattactattaccactactaaggcagtatgtcctaactcgttccagatcagcgctaacttcgattgaatgtgcgaaatttatagctcaatattttagcacttatcgtattgatttaagaaaaaattgttaacattttgtttcagTATGTCGCTTATACAAATGCAAACATCAATGATTTTGATGAGGACTATTTTGGGAGTGATGTCACTGTCCAAAGTAGTAATACAACAGATGAAATAATTAGAGATGCATCTGGGGCAGTTATCGAAGAACAAATTACAACTAAAAAAATGCAACGGAAAAATAAAAACCATGGAATACTTGGAAAAAATGAAAAAATGATCAAGACGTTCGTTATAACCACGGATTCCGACGGTAACGAGTCCATTGTAGAGGAAGATGTGCTCATGAAGACACTTTCCGATGGTACTGTTGCTCAAAGTTATGTTGCTGCTGATGCGGGAGCATATTCTCAGAGCGGGCCATACGTATCAAACAGTGGATACAGCACTCATCAAGGATATACGAGCGATTTCAGC本发明利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法，依次包括下列步骤(1)载体的构建本发明利用的pBac[3XP3-DsRedaf]注射转座子载体是piggyBac衍生来载体，它是将来自于pSL-3XP3-DsRedaf的1.3kb EcoRI/NruI的平端片段克隆进用BgIII/HpaI酶切并被补平的p3E1.2载体(Cary et al.，1989)，重组pBac[3XP3-DsRedaf]注射转座子载体是参照Horn& Wimmer(2000)的利用pSLfa1180fa克隆穿梭载体采用两步克隆法构建的，首先，复杂的构建都在含有所有可能识别6个碱基的限制性内切酶和Notl的多克隆位点的pSLfa1180fa克隆穿梭载体中完成，然后，构建好的重组pSLfa1180fa克隆穿梭载体用识别10个碱基的限制性内切酶Ascl和Fsel消化，得到的重组部分最后被克隆进pBac[3XP3-DsRedaf]形成目的重组注射载体；启动子元件的PCR扩增是用含有家蚕品种p50丝心蛋白基因的细菌人造染色体(BAC)克隆(下面简称H-chain BAC)为模板(Wu et al.，1999)，EGFP基因是从pBS-A3EGFP质粒的中扩增得到，具体构建如下首先是不同元件片段的获得丝心蛋白重链启动子3(简称为Fib-H P3)由丝心蛋白重链基因5′-上游序列，外显子1，内含子1和外显子2的5′端非重复序列组成，它是用Fib-H-P-f和Fib-H-P-r(63846-63823)引物对从H-chain BAC扩增获得；轻链结合位点(简称为LBS)由包含Cys-c20(C-端的倒数第20个氨基酸)的丝心蛋白重链基因的3′端和包含重链基因多聚腺嘌呤化信号序列的3’端下游序列组成，它是用含有一个BamHI位点的LBS-f(79027-79043)(5′-gtacggatccaAGTTACGGAGCTGGCAG-3′)和含有一个Sall位点的LBS-r(79359-79335)(5′-gcgcgtcgacTAGTACATTCAAATAAAATGCATAC-3′)从H-chainBAC扩增获得；EGFP基因是用含有一个XbaI位点的pEGFP-f(5′-ctagtctagaATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3′)和含有一个BamHI位点的pEGFP-r(5′-cagtggatcCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′)从pBS-A3EGFP质粒扩增获得，上面的PCR扩增条件是94℃预变性5分钟，5个94℃1分钟，50℃1分钟和72℃1分30秒的循环，然后是25个94℃1分钟，55℃1分钟；和72℃1分30秒的循环，接下来是72℃7分钟和4℃保存；然后是这些扩增元件按照下面的方法克隆进pSLfa1180fa(下面简称为pSL)穿梭载体①克隆LBS片段进pSL穿梭载体获得pSL-LBS质粒；②克隆EGFP片段进pSL-LBS质粒获得pSL-LBS-EGFP质粒；③克隆Fib-H P1片段进pSL-LBS-EGFP质粒获得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P1质粒，而克隆Fib-H P3片段进pSL-LBS-EGFP质粒获得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3质粒；④克隆外显子2的5′端非重复序列片段进pSL-LBS-EGFP质粒获得pSL-LBS-EGFP+5’-Exon2质粒，然后再克隆丝心蛋白重链基因5’-上游序列和外显子1的片段进pSL-LBS-EGFP+5’-Exon2质粒而获得pSL-LBS-EGFP+Fib-H 2质粒；最后，把获得的pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3质粒的重组部分克隆进pBac[3XP3-DsRedaf]载体，获得重组注射载体pBac[3XP3-DsRedaf]-R3；(2)转基因家蚕的获得pHA3PIG(Tamura et al.，2000)被用作辅助质粒产生转位酶，用QIAGEN Plasmid Midikit(Qiagen)试剂盒纯化注射质粒DNA，采用Kanda & Tamura(1991)描述的方法进行家蚕胚胎显微注射，注射后的蚕卵用无毒胶封口，在25℃条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体；最后，获得的转基因个体饲养、传代，并进行表达的检测和表达效率的测量。
启动子特异表达的检测和表达效率的测量可用如下方法启动子注射载体获得的转基因家蚕用不同的探针进行Southern blot和Northern blot分析以及用EGFP抗体进行Western blot分析。实验中的所有核酸探针都是用地高辛标记试剂(DIG-High Prime reagent(Boehringer Mannheim，U.S.))进行标记。①Southern blot分析用酚-氯仿法从G1代的蛾或G2代的第7天的蛹抽提转基因家蚕基因组DNA。6ug的基因组DNA用Spe I内切酶完全消化，电泳后转移到尼龙膜(Hybond N+，AmershamBioscience)上，固定后进行杂交实验。探针是EGFP片段；②Northern blot分析取～100mg的五龄第四天家蚕后部丝腺用1mL的TRIzolreagent(Invitrogen，U.S.)抽提后部丝腺总RNA。用10μg的总RNA电泳并按照标准方法进行Northern blot分析(Sambrook et al.，1989)。探针用EGFP探针和丝心蛋白重链3’端探针。丝心蛋白重链3’端片段是用LBS-f(79027-79043)(5′-gtacggatccaAGTTACGGAGCTGGCAG-3′)和Fib-H 3′-endR(5′-ttttttAAATGCTCTCATTTATTAACG-3′)引物对从pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3质粒扩增获得。实验可估计外源基因EGFP的相对转录和表达量；③Western blot分析去掉乱丝的茧碎片溶解于60％的LiSCN溶液中(按照约0.025g的茧片/1ml of 60％LiSCN比例进行溶解和处理)，然后离心取上清液，并用Tris缓冲液(10mM Tris-HCl pH＝7.0，2％SDS，5％β-巯基乙醇)稀释5倍后作为实验分析的样品。这些样品与5×加样缓冲液混合并在100℃变性3分钟后上样于10％SDS-聚丙稀酰胺胶并进行Western blot分析。Western blot分析的抗体是GFP Epitope Tag(Affinity BioReagents，U.S.)，GFP量的估计的标准样品是利用PA1-980A Neutralizing Peptide(Affinity BioReagents，U.S.)。实验可估计转基因蚕茧中EGFP的含量。
本发明的优点是，首次开发和利用了家蚕重链蛋白启动子，通过转基因家蚕大量表达外源表达蛋白，含量远远高于利用轻链蛋白和fhx启动子在转基因家蚕丝腺里产生外源蛋白的含量，利用轻链蛋白和fhx启动子在转基因家蚕丝腺里产生外源蛋白的含量，它们分别为0.84％和0.1％，而本方法外源蛋白的表达含量可达到16％左右。解决这一瓶颈，创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，可拓宽家蚕的应用领域，保持蚕丝产业可持续发展，促进我国蚕学和昆虫学科的长远发展。利用该项技术流程，通过大量饲养目的转基因家蚕，就可以简单地收获转基因家蚕蚕茧而大量获得目的外源蛋白。
具体实施例方式
实施例选择家蚕品种用上述方法构建家蚕丝心蛋白重链启动子和目的外源蛋白基因的注射载体，并进一步获得目的转基因家蚕，经用上述方法测定，在转基因家蚕蚕茧中外源蛋白的表达含量为16％。
权利要求
1.一种利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法，其特征在于依次包括下列步骤(1)载体的构建本发明利用的pBac[3XP3-DsRedaf]注射转座子载体是piggyBac衍生来载体，它是将来自于pSL-3XP3-DsRedaf的1.3kb EcoRI/NruI的平端片段克隆进用BglII/HpaI酶切并被补平的p3E1.2载体(Cary et al.，1989)，重组pBac[3XP3-DsRedaf]注射转座子载体是参照Horn & Wimmer(2000)的利用pSLfa1180fa克隆穿梭载体采用两步克隆法构建的，首先，复杂的构建都在含有所有可能识别6个碱基的限制性内切酶和NotI的多克隆位点的pSLfa1180fa克隆穿梭载体中完成，然后，构建好的重组pSLfa1180fa克隆穿梭载体用识别10个碱基的限制性内切酶AscI和FseI消化，得到的重组部分最后被克隆进pBac[3XP3-DsRedaf]形成目的重组注射载体；启动子元件的PCR扩增是用含有家蚕品种p50丝心蛋白基因的细菌人造染色体(BAC)克隆(下面简称H-chain BAC)为模板(Wu et al.，1999)，EGFP基因是从pBS-A3EGFP质粒的中扩增得到，具体构建如下首先是不同元件片段的获得丝心蛋白重链启动子3(简称为Fib-H P3)由丝心蛋白重链基因5’-上游序列，外显子1，内含子1和外显子2的5’端非重复序列组成，它是用Fib-H-P-f和Fib-H-P-r(63846-63823)引物对从H-chain BAC扩增获得；轻链结合位点(简称为LBS)由包含Cys-c20(C-端的倒数第20个氨基酸)的丝心蛋白重链基因的3’端和包含重链基因多聚腺嘌呤化信号序列的3’端下游序列组成，它是用含有一个BamHI位点的LBS-f(79027-79043)(5’-gtacggatccaAGTTACGGAGCTGGCAG-3’)和含有一个SalI位点的LBS-r(79359-79335)(5’-gcgcgtcgacTAGTACATTCAAATAAAATGCATAC-3’)从H-chainBAC扩增获得；EGFP基因是用含有一个XbaI位点的pEGFP-f(5’-ctagtctagaATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’)和含有一个BamHI位点的pEGFP-r(5’-cagtggatcCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’)从pBS-A3EGFP质粒扩增获得，上面的PCR扩增条件是94℃预变性5分钟，5个94℃1分钟，50℃1分钟和72℃1分30秒的循环，然后是25个94℃1分钟，55℃1分钟；和72℃1分30秒的循环，接下来是72℃7分钟和4℃保存；然后是这些扩增元件按照下面的方法克隆进pSLfa1180fa(下面简称为pSL)穿梭载体①克隆LBS片段进pSL穿梭载体获得pSL-LBS质粒；②克隆EGFP片段进pSL-LBS质粒获得pSL-LBS-EGFP质粒；③克隆Fib-H P1片段进pSL-LBS-EGFP质粒获得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P1质粒，而克隆Fib-H P3片段进pSL-LBS-EGFP质粒获得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3质粒；④克隆外显子2的5’端非重复序列片段进pSL-LBS-EGFP质粒获得pSL-LBS-EGFP+5’-Exon2质粒，然后再克隆丝心蛋白重链基因5’-上游序列和外显子1的片段进pSL-LBS-EGFP+5’-Exon2质粒而获得pSL-LBS-EGFP+Fib-H2质粒；最后，把获得的pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3质粒的重组部分克隆进pBac[3XP3-DsRedaf]载体，获得重组注射载体pBac[3XP3-DsRedaf]-R3；(2)转基因家蚕的获得pHA3PIG(Tamura et al.，2000)被用作辅助质粒产生转位酶，用QIAGEN PlasmidMidi kit(Qiagen)试剂盒纯化注射质粒DNA，采用Kanda & Tamura(1991)描述的方法进行家蚕胚胎显微注射，注射后的蚕卵用无毒胶封口，在25℃条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体；最后，获得的转基因个体饲养、传代，并进行表达的检测和表达效率的测量。
全文摘要
一种利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法，突破转基因蚕中被表达的外源蛋白在丝心蛋白中的含量低的难点，首次开发和利用家蚕丝心蛋白重链启动子，通过转基因家蚕大量表达外源表达蛋白，含量远远高于利用轻链蛋白和fhx启动子在转基因家蚕丝腺里产生外源蛋白的含量，达到16％左右。解决这一瓶颈，创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，可拓宽家蚕的应用领域，保持蚕丝产业可持续发展。利用该方法，通过大量饲养目的转基因家蚕，可以简单地收获转基因家蚕蚕茧而大量获得目的外源蛋白。
文档编号A01K67/00GK1912116SQ20061005444
公开日2007年2月14日 申请日期2006年7月14日 优先权日2006年7月14日
发明者赵爱春, 夏庆友, 鲁成, 向仲怀 申请人:西南大学