专利名称：用生物技术选育抗螟玉米自交系杂交种子的方法
技术领域：
本发明涉及玉米种子的培养选育的方法，尤其是用生物技术选育抗螟玉米自交系杂交种子的方法。
背景技术：
玉米螟虫是世界性害虫，它分布面积很广，危害性极大。无论什么气候条件，每年都有轻重不同的发生，条件不宜为轻发生年，一代螟虫发生率在35-56％，气候适宜大发生年螟虫发生率在76-93％之间，轻年减产2-3成，大发生年减产5成以上，全国每年因玉米螟危害要减产703-1173亿斤。
目前我国解决螟虫危害办法有三条措施一是用药剂人工防治，该办法缺点是工作量太大，价格高，由于面积太广时间集中工作难度大，造成浪费大量的人力、物力和财力，而且污染环境，产品又有残留，不附合绿色食品要求。我省每年用于防治玉米螟的费用高达10亿元人民币，全国每年要浪费110多亿元，且效果不理想。
二是用生物防治，利用螟虫的天敌赤眼蜂，缺点是价格太高，面积太大，时间集中，育不出这么多赤眼蜂。办不到也推广不了。这两条目前生产上使用由于推广面积太小达不到防虫效果。
三是选育推广抗螟高产品种是最佳方案，该办法在源头上解决抗螟虫问题，不用药剂和生物防治达到防螟目的，是投资少，见效快，易推广的好办法。目前，美国已广泛使用推广。我国尚没有这样好品种。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗螟玉米自交系杂交种子的选育方法，通过发明人近二十年的研究试验攻关，终于培育出了高抗螟玉米自交系杂交种子，从根本上解决了玉米的抗螟问题。
用生物技术选育抗螟玉米自交系杂交种子的方法，其特征在于按照作物遗传规律，抗螟基因是受抗螟的主效基因即质量性状遗传所决定的，在抗螟优势模式下合成原始材料定向选育
1)选择育种；在发螟最重的地区，找发螟最重的品种，在发螟最重的品种中找发螟最轻的或不发螟的单株，在发螟最轻的单株中寻找不发螟的质量性状规律，见表4、表5，经多年的观察研究，抗螟的玉米单株必须同时具备以下四个质量性状①螟虫不寄生性；是指该种玉米一代螟虫成虫见到这种玉米苗不选择它，避开它，有过敏反应，见到这种玉米苗就飞跑了，不在上面产卵；其质量性状的特征是是玉米单株的幼苗叶鞘颜色和叶颜色统一一致性，见表1。
②抗生不适应性；是指该种玉米即使寄生了螟虫，但螟虫寄生后不能成活；其质量性状的特征是茎杆含水多、含汁液多、不适宜螟虫生存，必须选择主效基因垂直抗性、专化反应强的，以二代螟幼虫在茎杆钻孔长度小于5厘米死掉的，钻孔颜色是黑褐色的作为抗生不适应的选择依据，见表3。
③隐蔽错期性；是指该种玉米在生殖生长期，先出花丝后出雌棒的特性，即该种玉米能错开二代螟成虫产卵高峰期出棒的特性，这是抗二代螟虫最为关键性的质量性状；因为有46.8％的二代螟幼虫在雌穗节位上，有55.6％在雌穗上下第10-13节茎杆和叶的叶掖间，解剖证实错期性比正常不隐蔽的二代螟幼虫减少76.6％，见表2。
④生态补偿性；在选择前三个重要质量性状的同时，要特别注意抗螟共性的互相补偿，又要必须兼顾产量性状的源、库、流综合性状的充分发挥，即该玉米要同时具备既抗螟，又要高产，以实现抗螟、抗病、高产、优质高效的育种目标。
2)杂交育种，必须是在抗螟优势模式下合成原始材料把抗螟共性个性都组装进去，培育抗螟自交系种子；按育种目标，采取优势互补原则，在第三代时，对两个高抗螟自交系按血缘关系，选择远缘的进行杂交，观察其抗螟效果和配合力，符合育种目标的其亲本再进一步纯合，有苗头的但不符合上述四个质量性状其中之一的再加以改造，改造后再纯合，再组配，筛选，直到达到育种目标为止；对达到纯合体的自交系，按血缘关系不同杂交组配成杂交种，选择具有特殊配合力的亲本及杂交种，保留下来推广使用。
3)回交育种，必须是在抗螟优势模式下定向培育，进一步培育抗螟自交系种子；在子1代至5代的选择中，观察抗螟效果，寻找抗生不适应性的自交系，凡是一代螟虫发生率在20％以下二代螟幼虫在茎内钻孔长度小于5厘米的就留下来选择纯合，不符合的用抗生性强的自交系再回交一两次，再选择，反复选择纯合，直到达到育种目标变为纯合体，达到上述四个质量性状统一融为一身为止，至此，培育出具有四性的抗螟自交系种子。
4)上述培育出的抗螟自交系种子，选择质量性状符合上述四个质量性状的，进行远缘杂交，即得到本发明抗螟玉米自交系杂交种子。
本发明的优点是从根本上解决了玉米种子的抗螟问题，使一代螟虫的发生率由原来的93％以上降到了5％左右，个别好的自交系达到了免疫程度，提高了玉米的产量，避免了农药的使用，控制了玉米的残留农药，达到了绿色农作物的标准。
具体实施例方式
在玉米自交系各时期，选择什么样质量性状，才能达到上述四个质量性状的统一，彻底改变这种玉米的生物学长相，使主效基因质量性状彻底改变过来达到抗螟的目的呢？经过近二十年的研究，本发明人得出以下结论1)在幼苗期，寻找抗螟纯合体，即幼苗叶鞘颜色和叶颜色的统一一致性是决定对一代螟成虫的不寄生性的关键性质量性状。经过多年的研究试验，选择出两种类型的纯合体，一是A型，其特征是，幼苗叶颜色和叶鞘颜色均为白绿色，外观象高粱苗；二是B型，叶鞘颜色和叶颜色均为紫红色，外观是全紫苗的。这两种纯合体自交系具有极强的螟虫不寄生性，经过三个玉米螟大发生年的考验，其一代螟发生率均低于8％以下，个别好的玉米、自交系达到免疫程度。这两种自交系纯合体组配成的单交种F1代有极强的过敏坏死反应，抗螟效果一代螟发生率均在10％左右，见表1。
2)在生殖生长期，即出雌穗期，选择先出花丝(玉米绒)受粉后再出棒的自交系，来改变二代螟虫的活动场所，是二代螟成虫产卵的不寄生性的第二个关键质量性状，出雌穗时间是否和玉米螟二代成虫产卵高峰期遇在一起是决定二代螟活动场所的改变关键。抗螟玉米的出雌穗时间必须是能错过二代螟成虫产卵的高峰期，但又要保证玉米的正常受粉发育成熟，所以经七年攻关改造选择先出花丝后出棒的自交系才能解决这一问题。
3)在玉米的生殖生长至成熟期，也正是二代螟幼虫危害的高峰期，这时期玉米的长势、抗逆性、保绿性、茎杆的强度、硬度、茎内含水、汁液的多少，决定二代螟能否成活，是否适应生存的环境，是抗生不适应性的第三个关键性质量性状，这个质量性状选择的好与坏，决定抗螟育种的成败，应重点选择生长势强的，保绿性、抗逆性好的，重点是茎杆含水多，含汁液多的，主效基因垂直抗性，专化反应强的，作为抗生不适应性的关键质量性状，以二代螟幼虫在茎杆钻孔长度小于5厘米死掉的，钻孔颜色是黑褐色的作为抗生不适应的选择依据。
4)在玉米的生长周期里，作为生态的补偿性是指，在保证抗螟的重点质量性状的同时，要特别注意抗螟共性的相互补偿，又要必须兼顾构成产量性状的源、库、流综合性状的充分发挥出来，注意专化反应的突出性状作为补偿，抗螟的目的是夺取高产，不高产再抗螟也是没有意义的，所以要选择株型紧凑、光能利用率高，保证群体增产来解决源的问题，在室内考种时，要注意，棒大，棒粗，行数多，解决库的问题。在生育期，粒性状、米质等性状解决流的问题，这些优良的农艺性状的充分发挥，作到优势互补，才能育出既抗螟、又高产、优质、高效的杂交品种。
抗螟玉米自交系、杂交种的选育方法，其理论依据是按照作物遗传规律，抗螟基因是受抗螟的主效基因即质量性状遗传所决定的。转基因的最终目的是将目的质量性状，整合到受体基因组合中，在后代植株中稳定遗传和表达，通过定向选择鉴定得到具有应用价值的新品系，基因的表达需要适宜的内在环境，基因型一致等于表现型一致加环境一致，表现型一致等于基因型一致加环境一致。不同抗体基因可以位于同一载体，也可位于不同载体，同时导入受体中就会使玉米获得水平抗性或抗不同抗虫的能力，也可将不同的抗性基因分别导入父、母本使杂交种获得水平抗性和多抗性。转基因植株的目标性状得到表达或强化时，常伴随其它农艺质量性状的改变(水平抗性向垂直抗性由量变向质变的过程)，在多数情况下是朝着不利方向变化，所以必须是科学的，人为的定向选择。由于外源基因的导入很有可能引起相邻或相关基因发生易位，倒位，或重组，影响基因的表达，对应的策略是通过转化株和同群体未能转化株多代的姊妹交(即回交)，通过同源染色体之间易位，才有可能选择得到除了整合进目的基因外，染色体其它部位都正常的后代，可以设想，将多个抗螟目的基因分别转入到父母本中，达到辨证统一时，才能育出超双亲的高抗螟的自交系杂交种。
遗传和变异是对立统一规律，抗螟自交系的选育过程中要的就是变异，找出抗螟基因突变体，最终目的是使抗螟基因能稳定遗传。在育种实践中采取的办法是1、首先确定生物技术工程育种目标，通过改变玉米自交系生物质量性状，来改变其活动场所，使螟虫对该自交系杂交种不选择，不寄生，寄生后不适宜，不成活，不危害达到抗螟的目的。因为只有生物的质量性状改变纯合，才能达到抗螟主效基因的改变纯合，主效基因的改变纯合才能保证抗螟质量性状的稳定，抗螟质量性状的稳定，才能保证主效基因垂直抗性专化反应的纯合。
2、按上述的四个质量性状和生物质量标准，采用定向培育优选法即在田间优选，找出典型株，单株记载10-20株，在室内考种时严格把关，选出专化反映强的留下3-5株，明年再播，来年在田间再优选时兼顾一般农艺性状，经多代优选纯合，凡不符合育种目标的即淘汰；其具体选育方法是1)选择育种；在发螟最重的地区，找发螟最重的品种，在发螟最重的品种中找发螟最轻的或不发螟的单株，在发螟最轻的单株中寻找不发螟的质量性状规律，见表4、表5，经多年的观察研究，抗螟的玉米单株必须同时具备以下四个质量性状①螟虫不寄生性；是指该种玉米一代螟虫成虫见到这种玉米苗不选择它，避开它，有过敏反应，见到这种玉米苗就飞跑了，不在上面产卵；其质量性状的特征是是玉米单株的幼苗叶鞘颜色和叶颜色统一一致性，见表1。
②抗生不适应性；是指该种玉米即使寄生了螟虫，但螟虫寄生后不能成活；其质量性状的特征是茎杆含水多、含汁液多、不适宜螟虫生存，必须选择主效基因垂直抗性、专化反应强的，以二代螟幼虫在茎杆钻孔长度小于5厘米死掉的，钻孔颜色是黑褐色的作为抗生不适应的选择依据，见表3。
③隐蔽错期性；是指该种玉米在生殖生长期，先出花丝后出雌棒的特性，即该种玉米能错开二代螟成虫产卵高峰期出棒的特性，这是抗二代螟虫最为关键性的质量性状；因为有46.8％的二代螟幼虫在雌穗节位上，有55.6％在雌穗上下第10-13节茎杆和叶的叶掖间，解剖证实错期性比正常不隐蔽的二代螟幼虫减少76.6％，见表2。
④生态补偿性；在选择前三个重要质量性状的同时，要特别注意抗螟共性的互相补偿，又要必须兼顾产量性状的源、库、流综合性状的充分发挥，即该玉米要同时具备既抗螟，又要高产，以实现抗螟、抗病、高产、优质高效的育种目标。
2)杂交育种，必须是在抗螟优势模式下合成原始材料把抗螟共性个性都组装进去，培育抗螟自交系种子；按育种目标，采取优势互补原则，在第三代时，对两个高抗螟自交系按血缘关系，选择远缘的进行杂交，观察其抗螟效果和配合力，符合育种目标的其亲本再进一步纯合，有苗头的但不符合上述四个质量性状其中之一的再加以改造，改造后再纯合，再组配，筛选，直到达到育种目标为止；对达到纯合体的自交系，按血缘关系不同杂交组配成杂交种，选择具有特殊配合力的亲本及杂交种，保留下来推广使用。
3)回交育种，必须是在抗螟优势模式下定向培育，进一步培育抗螟自交系种子；在子1代至5代的选择中，观察抗螟效果，寻找抗生不适应性的自交系，凡是一代螟虫发生率在20％以下二代螟幼虫在茎内钻孔长度小于5厘米的就留下来选择纯合，不符合的用抗生性强的自交系再回交一两次，再选择，反复选择纯合，直到达到育种目标变为纯合体，达到上述四个质量性状统一融为一身为止，至此，培育出具有四性的抗螟自交系种子。
4)上述培育出的抗螟自交系种子，选择质量性状符合上述四个质量性状的，进行远缘杂交，即得到本发明抗螟玉米自交系杂交种子。
3、按孟德尔遗传规律，一对基因可以分离出四种类型，玉米是(2.5×109)多基因作物，两个品系杂交重组后要分离出若干个类型的不同株系，在玉米生长同一个周期里，对不同质量性状，如叶鞘颜色、叶型、叶色、叶亮度、叶缘、茎的颜色、茎杆强度、含水量、雄穗分支多少、尺寸、花丝颜色、出雌棒规律、生育期、保绿性、叶的开张角度、骨色、粒型等17项在田间及室内考种详细观察记载，找出抗螟的质量性状规律(共性)，如同姊妹系中红骨抗螟好于白骨，见表8，硬粒好于马齿等……，按抗螟共性掌握不适宜，不寄生，不危害，优势互补标准定向选择。但每个血缘关系共性不一样，所以每项都要一丝不苟定向选择，找出标准株单株记载套袋自交，对达不到目的的基因质量性状的株系就要重新组装改造，直到能达到基因表达时为止。
下面通过多年来本发明人的有关实验观察数据资料进一步说明本发明的实施方式。
见表32003年是螟虫大发生的一年，秋收前对抗生性强的组合25614连续解剖10株，有虫为3头，比对照沈16，10株有虫14头，减少11头，提高抗二代螟效果70.5％，而且在10株中连续9株内无一头虫全部死掉，只有第10株是变异株，在茎杆的上部，第16-19节中有虫3头，其余在茎杆水分多部位也没有虫，见表3，2005年同样是螟虫大发生年，对抗生性强的2267、D1457、945、36524等品种进行连续5株解剖都证明这点，实践证明二代螟虫在茎杆里蛀孔长度小于5厘米死亡的，蛀孔的颜色是黑褐色的，茎杆含水多的，坚硬的，是解决抗生不适应性关键的质量性状，而对照品种的沈单16、蛀孔长度达35-57厘米，螟虫仍成活的很好，其蛀孔颜色和玉米杆颜色相同黄白色，这样品种抗生性就很差，所以蛀孔颜色为黑褐色，在茎内蛀孔小于5厘米死亡的，作为抗生选择好坏的依据。
抗螟育种始于1992年，这一年是海城地区发螟最重，减产最多的一年，无论平原、山区、沿河，也不论是丹玉二号，丹玉6号，铁单9号、掖单13号、海单二号，所有品种100％的大发生，以丹玉6号发螟最重，一场秋风过后，在田间找不到一株完整株，几乎全部折断，减产4-5成。本发明人调查了海城的平原、山区、沿河、丹玉6号发螟情况，每区调查二个点各100株，寻找抗源的品种，见表4、表5。选择单株有虫最少那棒玉米为抗源材料，并以它的质量性状为标准做为定向依据。
从表6中可以看出同一个品种中，由于叶鞘颜色的不同，抗螟效果不一样，粉红色叶鞘的明显优于紫红色叶鞘的，提高抗一代螟发生率30.8-34.9％。94年以抗粉6为基础材料做母本和当地配合力高的抗螟好的丹340变异株自交系为父本进行杂交开始攻关。
从表7中可看出，宏T6自交系转育中发现，叶鞘颜色这个质量性状，决定了这个自交系的驱避排他性的特点，凡白绿色叶鞘的好于粉红色的，粉红色好于紫红色的，但不同血缘的自交系纯合后颜色不一致。
经多年育种的实践证明，同血缘自交系间的秭妹系，由于骨色不同其抗螟效果差异很大。一般规律是红骨好于白骨的，见表8。
从表8中看出，由于父本骨色不同抗螟效果大不一样，但产量和生育期基本相同，从抗螟育种上应重点发挥红骨材料是比较好的。
现以宏T643自交系的特征特性分述如下该自交系生育期125天，株高160-180cm，棒位70-80cm，19片叶，雄穗分枝20-30个花丝白绿色棒长10-17cm，粗5.2-5.5cm，筒形20-22行，红骨，方马齿粒，黄色。
在整个生育期表现是出苗后苗基叶鞘颜色白绿色，叶长叶窄，白绿向高梁苗，定植后叶明显由长叶向宽转移呈灰绿色，叶开始上举，到营养生长末期，茎杆开始粗壮叶密口大，灰绿上举，前期蹲苗长根，转入生殖期后，茎杆迅速生长，叶向横向发展变宽变硬直立上冲，叶宽达到16公分，叶向背卷曲，叶上有皱褶，叶和杆开张角度很小，几乎是抱杆生长，杆茎呈红柴色直立上冲，雌穗在叶掖间包着，不出棒先出花丝，授粉后才长棒。该自交系最大特点是抗螟虫最好，正常年螟虫基本上不发生，大发生年一代螟虫发生率在7％以下，抗倒伏，抗大小斑病，抗丝黑穗病，花粉量大，适于作父本，用抗螟系列自交系组配的高抗螟高产优质组合有A25×T614 D100-5×A53-1 A6×D100-4A53×T612 D61×A21 A12×A25A33×T613 A20×A57 A33×A36A21×T643 A68×A2B97×B109A40×T731 D9522×A72 A1×A40抗螟高产优质玉米杂交种A25×T614特性该品种生育期130天，株高260cm，棒位130cm，19片叶，棒长26-28cm粗5.2-5.6cm，14-16行，筒形，红骨，行粒数54，扁马齿粒，橙黄色，米质优，在生育期表现是抗螟虫，在正常年一代螟发生率在5％以下，大发生的2003年一代螟发生率在30％以下，比对照品种辽单16一代螟发生率84.6％减少54.6％提高抗螟效果64.5％，二代螟虫10株解剖为3头，比对照品种辽单16，10株有虫14头，减少11头提高抗二代螟虫危害率70.5％，(而且在10株中有9株内无一虫，只有一株是杂株有虫3头)。
抗丝黑穗病，成棒率高，无空杆，抗倒伏，抗大小斑病，青枯病，活杆成熟，叶宽上冲，亩产1616斤，比对照辽单16亩产1408斤，每亩可增产208斤，增产14.7％。
按照这个品种的增产幅度，每亩增产200斤，辽宁省2500万亩玉米如能使用该品种，每年可增产玉米50亿斤，每斤按价0.5元计算，可年增效益25亿元，全国如能推广使用面积达十分之一，是3500万亩每年可增产700亿斤，年增效益350亿元，如果这个品种一推广，我国就可还头赶上和超过目前世界发达国家的美国，而处于世界领先地位。
表1不同年份、不同叶鞘、叶颜色对一代螟发生率统计表
表2三个在玉米螟大发生年十四个品种二代螟在玉米株危害规律统计表
表3抗生性强组合增产幅度及抗螟情况汇总表
表492年海城地区螟虫危害调查表
表5丹玉六号不同单株感虫与抗虫质量性状差异表
表693年抗螟株物相观测统计表
表7宏T6系列抗螟自交系转育过程模式统计表
表8相同组合、由于父本骨色不同抗螟效果不同
权利要求
1.用生物技术选育抗螟玉米自交系杂交种子的方法，其特征在于按照作物遗传规律，抗螟基因是受抗螟的主效基因即质量性状遗传所决定的，在抗螟优势模式下合成原始材料定向选育1)选择育种；在发螟最重的地区，找发螟最重的品种，在发螟最重的品种中找发螟最轻的或不发螟的单株，在发螟最轻的单株中寻找不发螟的质量性状规律，经多年的观察研究，抗螟的玉米单株必须同时具备以下四个质量性状①螟虫不寄生性；是指该种玉米一代螟虫成虫见到这种玉米苗不选择它，避开它，有过敏反应，见到这种玉米苗就飞跑了，不在上面产卵；其质量性状的特征是是玉米单株的幼苗叶鞘颜色和叶颜色统一一致性；②抗生不适应性；是指该种玉米即使寄生了螟虫，但螟虫寄生后不能成活；其质量性状的特征是茎杆含水多、含汁液多、不适宜螟虫生存，必须选择主效基因垂直抗性、专化反应强的，以二代螟幼虫在茎杆钻孔长度小于5厘米死掉的，钻孔颜色是黑褐色的作为抗生不适应的选择依据；③隐蔽错期性；是指该种玉米在生殖生长期，先出花丝后出雌棒的特性，即该种玉米能错开二代螟成虫产卵高峰期出棒的特性，这是抗二代螟虫最为关键性的质量性状；因为有46.8％的二代螟幼虫在雌穗节位上，有55.6％在雌穗上下第10-13节茎杆和叶的叶掖间，解剖证实错期性比正常不隐蔽的二代螟幼虫减少76.6％；④生态补偿性；在选择前三个重要质量性状的同时，要特别注意抗螟共性的互相补偿，又要必须兼顾产量性状的源、库、流综合性状的充分发挥，即该玉米要同时具备既抗螟，又要高产，以实现抗螟、抗病、高产、优质高效的育种目标；2)杂交育种，必须是在抗螟优势模式下合成原始材料把抗螟共性个性都组装进去，培育抗螟自交系种子；按育种目标，采取优势互补原则，在第三代时，对两个高抗螟自交系按血缘关系，选择远缘的进行杂交，观察其抗螟效果和配合力，符合育种目标的其亲本再进一步纯合，有苗头的但不符合上述四个质量性状其中之一的再加以改造，改造后再纯合，再组配，筛选，直到达到育种目标为止；对达到纯合体的自交系，按血缘关系不同杂交组配成杂交种，选择具有特殊配合力的亲本及杂交种，保留下来推广使用；3)回交育种，必须是在抗螟优势模式下定向培育，进一步培育抗螟自交系种子；在子1代至5代的选择中，观察抗螟效果，寻找抗生不适应性的自交系，凡是一代螟虫发生率在20％以下二代螟幼虫在茎内钻孔长度小于5厘米的就留下来选择纯合，不符合的用抗生性强的自交系再回交一两次，再选择，反复选择纯合，直到达到育种目标变为纯合体，达到上述四个质量性状统一融为一身为止，至此，培育出具有四性的抗螟自交系种子；4)上述培育出的抗螟自交系种子，选择质量性状符合上述四个质量性状的，进行远缘杂交，即得到本发明抗螟玉米自交系杂交种子。
全文摘要
本发明涉及用生物技术选育抗螟玉米自交系杂交种子的方法，其特征是按照作物遗传规律，抗螟基因是受抗螟的主效基因即质量性状遗传所决定的，在抗螟优势模式下合成原始材料定向选育1)选择育种，2)杂交育种，3)回交育种，上述培育出的抗螟自交系种子，选择质量性状符合螟虫不寄生性、抗生不适应性、隐蔽错期性、生态补偿性四个质量性状的，进行远缘杂交，即得到本发明抗螟玉米自交系杂交种子。本发明的优点是从根本上解决了玉米种子的抗螟问题，使一代螟虫的发生率由原来的93％以上降到了5％左右，个别好的自交系达到了免疫程度，提高了玉米的产量，避免了农药的使用，控制了玉米的残留农药，达到了绿色农作物的标准。
文档编号A01H1/04GK1806517SQ200610045758
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月26日 优先权日2006年1月26日
发明者佟恩宏, 佟旭, 佟丹, 佟宇 申请人:佟恩宏