专利名称：一种能防除连作作物枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料的利记博彩app
技术领域：
本发明一种能防除连作作物枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术，专用于克服和消除连作作物的枯萎病问题。
二、技术背景瓜果、蔬菜、棉花等作物的连作障碍是全球集约化农业生产的瓶颈问题，成千上万公顷的设施农业土壤由于连作障碍而不断被弃置，极大地浪费了设施农业投入的财力、人力和物力，即便是大面积露地生产的黄瓜、西瓜、番茄、大豆、青椒、棉花等作物也由于连年种植而产生严重的连作障碍，极大地影响了广大农民种田的经济效益。农民们只好每隔2-3年对这些土壤用溴甲烷进行消毒，不仅极大地加大了农民的生产成本(800元/亩)，而且，严重污染了土壤环境，影响农产品安全，政府正在严格控制或禁止使用此类土壤消毒剂，但是，广大农民们感到十分茫然，急剧呼吁政府和科技部门能给他们指点，以挽救这一逐渐恶化的事件。连作作物的土壤障碍中连作枯萎病是最严重的障碍因子，其主要由真菌性病原菌(尖孢镰刀菌)引起，在连作2茬时就开始出现，连作4茬就基本颗粒无收。我们的长期研究结果表明，连作作物枯萎病的关键问题不是养分缺乏或不平衡，也不是土壤次生盐渍化问题，而是土壤中的微生物区系及其次生物质的致毒问题。
另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原料；大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因收获作物取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用于功能菌的载体，所制成的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。
发明内容
1.技术问题本发明的目的在于研制一种能防除连作作物枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料，克服连作作物枯萎病或消除连作作物枯萎病效率达到80％以上，使大量的设施农业土壤和露地连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。
2.技术方案一种能克服或消除连作作物枯萎病的拮抗菌，该微生物是革兰氏染色阳性的多粘类芽孢杆菌属(Paenibacillus polymyxa)的菌株KKW-021，2005年9月15日寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.1544，主要生物学特性为革兰氏染色阳性(G+)，细胞形状为杆状(＜1μm)，形成芽孢(端生膨大)，兼性厌氧生长，接触酶反应阳性、氧化酶反应阴性、V.P.反应(V.P＜pH6.0)阳性，甲基红试验阳性，氧化葡萄糖产酸产气，氧化木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸，不能利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阴性，分解酪蛋白阳性。
上述拮抗菌是从已经发病的植株和土壤中分离得到，为芽孢杆菌属，通过分子鉴定，其16srDNA序列为SEQ.ID.NO.1。
用上述一种能克服或消除连作作物枯萎病拮抗菌所生产的微生物有机肥料中含有1×108个/g以上的拮抗微生物数量、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。其生产方法包括1)选用拮抗菌，进行发酵生产，其发酵生产的条件为pH生长范围自然，培养温度范围24～41℃，溶氧30～100％条件下通气量范围为180～300转/分钟，液体培养基为PDA单糖加富，发酵周期27～31小时，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌(芽孢)量≥1×1010个/ml；2)以干重计将作物秸秆畜禽粪便无机氮肥以30～40∶60～70∶1～3混合后发酵，待堆肥温度上升至60-70℃时维持5-7天；堆肥温度至60℃时维持5-7天，每2-3天翻堆一次；上述每次翻堆时再加入0.5～1％的无机氮；堆肥温度从50-60℃开始降温3～5天，立即停止，获得拮抗菌的载体生物有机物料；3)每吨固体有机物料中加入拮抗菌液10-50L混合，制成含拮抗菌(芽孢)数量达到1×108个/g以上的微生物有机肥料。
其生产方法中拮抗菌发酵最适生长温度37.5℃，加富培养基的糖类指的是葡萄糖、蔗糖。生物合成有机氮所用的无机氮肥是氯化铵或硫酸铵。所用作物秸秆是粉碎至1～5cm的水稻和小麦秸秆。所用拮抗菌的载体生物有机物料(有机堆肥)的氮90％以上是有机态氮。
3.有益效果本发明一种能克服或消除连作作物枯萎病的微生物有机肥料及其生产方法，利用畜禽粪便中的发酵微生物和作物秸秆中丰富的碳源以及少量无机氮在短时间内发酵成含有丰富的可溶性碳和有机氮含量高的有机物料，再与拮抗菌液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点1)肥料产品中含有抑制枯萎病原真菌生长的高效菌株(芽孢杆菌)，其抑制效果非常显著，肥料中高效菌株的含量达到1×108个/g以上，施入土壤后能形成优势群，并在土壤中存活下来。
2)肥料产品中含有丰富的可溶性碳和有机氮，能给功能菌提供十分优越的生长环境，极大地提高了外来功能菌在土壤中的定殖和发挥功能的能力。
3)堆肥过程添加了高温和中温纤维分解菌，堆肥发酵时间控制在15天左右(春、夏、秋季)和20～25天(冬季)，同时，控制使作物秸秆的分解处于中期阶段，施入土壤后会立即继续分解，从而使土壤中有益微生物区系(主要为细菌)大量繁殖。
4)本发明产品有机磷和有机氮含量特别高，均达到4％。本产品原料之一为畜禽粪，总磷含量很高，而且生物有效性特别高，在做成微生物有机肥料产品中无需添加任何含磷化肥，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性较差；而本产品中有机氮能达到4％以上，确保了肥料氮素持续稳定的供应，使所种作物生长和抗逆能力大大增强。
5)本产品生产原料来源广而丰富，原料成本很低，生产工艺简便，固定资产投入少，生产过程中耗电耗水极少，因此产品价位低而针对性强，企业每生产1吨微生物有机肥料的所有成本不超过600元，而象这种特效专用为生物有机肥料价格很高，一般在1500元/吨，而且目前市场上非常紧缺，因此本产品具有强大的社会、环境和经济生命力。
6)试验结果表明，在西瓜、黄瓜、番茄等连作作物的土壤上施用本产品后，能显著消除其连作枯萎病，消除率达80％以上，即没有施用本肥料处理的，连作土壤上作物的果实产量几乎接近零，而施用本肥料处理的作物果实产量为没有连作障碍土壤的80％，连续三年施用本肥料的土壤，连作障碍消除率更高。
具体实施例方式
拮抗菌株的获得采集已经发生连作障碍并出现枯萎病病症的植株和周围土壤，样品低温保存，采用MGA2.5+PCNB枯萎病选择性培养基获得病原菌株，分别利用NA改良培养基、PDA改良培养基和LB改良培养基利用对峙法进行拮抗试验，初筛拮抗菌株、通过盆栽试验复筛高效拮抗菌株，经过生理生化和16srDNA分子鉴定确定属种，菌种冻干-20℃保存。
拮抗菌株的生产放大培养利用菌种加富培养基进行高密度扩大培养获得高浓度发酵液(含菌量≥1×1010个/ml)，发酵条件培养基PDA加富(加富主要成份有淀粉、麸皮、蔗糖等)，培养温度37.5℃、pH7.0-7.4，溶氧前期100％-80％、中期80％-40％、后期60％-40％、最后100％，放罐条件有效活菌数≥1×1010个/ml、芽孢含量≥95％。
将作物秸秆畜禽粪便无机氮按30～40∶60～70∶1～3(以干重计)混合后发酵，待堆肥温度上升至60～70℃时维持5～7天(每天翻堆一次)，再待堆肥温度上升至60℃左右时维持5～7天(每2-3天翻堆一次)，上述每翻堆一次再添加0.5～1％的无机氮，直至堆肥温度从50～60℃开始降温，再维持3～5天立即停止，风干待用。
发酵生产的拮抗菌液(已形成芽孢)加入到发酵后的优质有机物料混合制成微生物有机肥料，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液10-50L，使微生物有机肥料中的拮抗菌(芽孢)数量达到1×108个/g以上，包装，存放于阴凉、干燥处。
实施例将作物秸秆∶畜禽粪便∶无机氮按30∶68∶2(以干重计)混合后发酵，待堆肥温度上升至60～70℃时维持5～7天(每天翻堆一次)，再待堆肥温度至60℃左右时维持5～7天(每2-3天翻堆一次)，上述每翻堆一次再添加0.5％的无机氮，直至堆肥温度从50～60℃开始降温，再维持3～5天立即停止，风干待用。将发酵生产的拮抗菌液(已形成芽孢)加入到发酵后的优质有机物料中混合制成微生物有机肥料，其产品的主要性状如表1。
表1本发明生物有机肥料产品某些特性
表1表明通过本发明技术及生产工艺生产的产品中有机质(总有机碳×1.7)含量为30％以上，且含有很高比例(4.9％)的可溶性碳(以碳为计，若以有机质计则更高)，这是该产品施入土壤后拮抗功能菌和土著有益微生物(细菌)大量繁殖的物质基础；本产品中还有一个特色就是有机氮和有机磷含量特别高，分别达到4.12％和4.36％，施入土壤后不仅显著促进土壤微生物的生物活性，而且大大提高土壤氮磷养分的可供给性，使作物生育期内营养处于良好状态；产品中拮抗枯萎病的拮抗菌活菌数达到1×108个/g，且95％以上为芽孢状态，产品保存时间较长。以上特性充分说明了本发明技术及生产工艺制造的特种微生物有机肥料的可行性。
本发明所研制的特种生物有机肥料对连作土壤上作物的增产效应非常显著(见表2)，由表2可知在有连作作物枯萎病的土壤上如果不施用本产品，西瓜和黄瓜的产量很低(401±29.4g/株，142±48.1g/株)，而没有连作作物枯萎病的同样的土壤上产量较高(3864±204g/株，1321±125g/株)，说明试验所用的土壤连作枯萎病很严重，在该土壤上施用本产品后西瓜和黄瓜的产量聚增(表2第3行与第2行比)，他们分别达到了没有连作作物枯萎病土壤产量的81％和82％，说明本产品在克服连作作物枯萎病效果方面是非常显著的。
本发明所研制的特种微生物有机肥料对连作土壤上微生物区系的影响也非常显著(见表3)，由表3可知有连作作物枯萎病的土壤上真菌数量0.7×105个/g土，显著高于无连作作物枯萎病的土壤的真菌数量(5×103个/g土)、而有连作作物枯萎病的土壤上细菌数量为2.2×109个/g土，显著低于无连作障碍的土壤细菌数量5.1×1010个/g土，说明连作土壤上真菌(主要为病原真菌)的大量繁殖是作物连作障碍的根本因子，施用本发明产品后微生物区系得到大大改善，其细菌数量接近于无连作障碍的土壤，而真菌的数量聚然减少至0.8×104个/g土，与无连作障碍的土壤没有显著性差异。
表2本发明特种生物有机肥对连作枯萎病土壤上作物的增产效应(田间试验)
注所有肥料均一次性施入表3本发明特种生物有机肥对连作枯萎病土壤上微生物区系的影响(盆栽试验)
注所有肥料均一次性施入上述实施例中用硫酸铵代替氯化铵是普通技术人员可以做到的，能达到同样的效果。
本发明专利从微生物区系及其次生物质致毒这一关键问题着手，研制出一种能显著消除作物连作枯萎病发生的微生物有机肥料产品，消除率达80％以上。本肥料产品的作用机制在于本肥料产品提供的功能菌及其有效碳和有效氮源给连作障碍土壤有益微生物区系的培育提供了很好的条件，使之迅速恢复土著有益微生物和外源功能菌微生物的生态及其食物链；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障碍土壤中作物的生长十分有利，大大提高了作物的立苗率和抗逆能力。
序列表<110>南京农业大学<120>一种能防除连作作物枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料<130>说明书<140>000<141>2005-12-06<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>SEQ ID NO.1<211>912<212>DNA<213>Paenibacillus polymyxa(多粘类芽孢杆菌属)<220>
<221>16srDNA<222>(1)..(912)<223>
<400>1caccccaatc atctacccca ccttcggcgg ctggctcctt gcggttacct caccgacttc 60gggtgttgta aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aagacccggg aacgtattca120ccgcggcatg ctgatccgcg attactagca attccaactt catgtaggcg agttgcagcc180tacaatccga actgagaccg gcttttctag gattggctcc acctcgcggc ttcgcttccc240gttgtaccgg ccattgtagt acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac300gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctgc ttagagtgcc cagcttgacc360tgctggcaac taagcataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac420acgagctgac gacaaccatg caccacctgt ctcctctgtc ccgaaggaaa ggcctatctc480tagaccggtc agagggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac540cacatactcc actgcttgtg cgggtccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc600gtactcccca ggcggaatgc ttaatgtgtt aacttcggca ccaagggtat cgaaacccct660aacacctagc attcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc720ccacgctttc gcgcctcagc gtcagttaca gcccagagag tcgccttcgc cactggtgtt780cctccacatc tctacgcatt tcacgctaca cgtgattcca ctctctctct gcactcagct840ccccagtttc agtgcgaccg agtgagcctc gggattaaca ccagacttaa agagcgctgc900gcgcgcttta cg91权利要求
1.一种能克服或消除连作作物枯萎病的拮抗菌，其特征在于，该微生物是革兰氏染色阳性的多粘类芽孢杆菌属(Paenibacillus polymyxa)的菌株KKW-021，2005年9月15日寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.1544，主要生物学特性为革兰氏染色阳性(G+)，细胞形状为杆状，端生膨大形成芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阴性、V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，氧化葡萄糖产酸产气，氧化木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸，不利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阴性，分解酪蛋白阳性。
2.根据权利要求1所述一种能克服或消除连作作物枯萎病的拮抗菌，其特征在于，该拮抗菌是从已经发病的植株和土壤中分离得到，为芽孢杆菌属，通过分子鉴定，其16srDNA序列为SEQ.ID.NO.1。
3.用权利要求1或2所述一种能克服或消除连作作物枯萎病拮抗菌所生产的微生物有机肥料。
4.根据权利要求3所述能克服或消除连作作物枯萎病拮抗菌微生物有机肥料，其特征在于该肥料中含有1×108个/g以上的拮抗微生物数量、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。
5.根据权利要求3或4所述能克服或消除连作作物枯萎病拮抗菌微生物有机肥料，其生产方法包括1)选用拮抗菌KKW-021，进行发酵生产，其发酵生产的条件为pH生长范围自然，培养温度范围24～41℃，溶氧30～100％条件下通气量范围为180～300转/分钟，液体培养基为PDA加富，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌量≥1×1010个/ml；2)以干重计将作物秸秆∶畜禽粪便∶无机氮肥以30～40∶60～70∶1～3混合后发酵，待堆肥温度上升至60-70℃时维持5-7天；堆肥温度至60℃时维持5-7天，每2-3天翻堆一次；上述每次翻堆时再加入0.5～2％的无机氮肥；堆肥温度从50-60℃开始降温3～5天，立即停止，获得拮抗菌的载体生物有机物料；3)每吨固体有机物料中加入拮抗菌液10-50L混合，制成含拮抗菌数量达到1×108个/g以上的微生物有机肥料。
6.根据权利要求5所述能克服或消除连作作物枯萎病拮抗菌微生物有机肥料，其生产方法中拮抗菌发酵生产温度为37.5℃。
7.根据权利要求5所述能克服或消除连作作物枯萎病拮抗菌微生物有机肥料，其微生物发酵生产方法中培养基PDA加富的中糖类指的是葡萄糖、蔗糖、淀粉。
8.根据权利要求5所述能克服或消除连作作物枯萎病拮抗菌微生物有机肥料，其生产方法中生物合成有机氮所用的无机氮肥是氯化铵或硫酸铵。
9.根据权利要求5所述能克服或消除连作作物枯萎病拮抗菌微生物有机肥料，其生产方法中所用作物秸秆是粉碎至1～5cm的水稻和小麦秸秆。
10.根据权利要求5所述能克服或消除连作作物枯萎病拮抗菌微生物有机肥料，其生产方法中所用拮抗菌的载体生物有机物料的氮90％以上为有机态氮。
全文摘要
本发明一种能克服或消除连作作物枯萎病的拮抗菌及其生产的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了对枯萎病原真菌有显著拮抗作用的拮抗菌(芽孢杆菌)，拮抗菌与有机堆肥混合制成微生物有机肥料，肥料中含有1×10
文档编号A01P1/00GK1775035SQ200510122898
公开日2006年5月24日 申请日期2005年12月7日 优先权日2005年12月7日
发明者沈其荣, 杨兴明, 黄启为, 徐阳春 申请人:南京农业大学