专利名称：牛卵母细胞的活体取卵方法
技术领域：
本发明属于生物工程和农业科学领域，具体地说，本发明涉及胚胎体外生产技术，更具体地说，是关于一种牛卵母细胞的活体取卵方法。
背景技术：
活体取卵技术(Ovum pick up，OPU)是起始于二十世纪80年代末的一项胚胎生产技术，在超声波(B超)的监视下通过阴道壁从活的母牛卵巢采集牛卵母细胞。它的原理是利用不同组织，如液体、脂肪和肌肉等对高频率声波吸收和发射的能力不同，在屏幕上显示不同组织、不同剖面的图像。例如卵巢上的黄体及卵巢实质等较硬的组织反射声波的能力较强，显示明亮的图像；而含有卵泡液的卵泡反射声波的能力较弱，显示较暗的图像，以此图像引导穿刺靶点。
卵母细胞是进行胚胎学研究和胚胎体外生产的前提。经典的奶牛胚胎体外生产的卵母细胞的途径主要来源于屠宰场的卵巢，但存在一定的缺点。从屠宰场获得卵巢取卵，虽然可得到较多的廉价卵母细胞，但是，这些卵母细胞遗传背景不清楚，无法用于奶牛的遗传育种改良；并且，屠宰场离实验室通常较远，长时间的运输会对卵母细胞造成一定的损伤；此外，由于不知卵巢来源母牛的健康状况，生物安全性也较差，特别在上海地区获得卵巢的数量极少、质量也差。因此，一种新型的获得卵母细胞方法——活体取卵技术运应而生。1988年pieterse等首次报道了牛的B超活体取卵技术(Pieterse MC，Kappen KA，KruipThAM，et al.Theriogenology，1988，30(4)751-761)。此后，该技术与相关胚胎体外生产技术结合，显示出巨大的应用潜力并得到较为迅速的发展。它可对具有遗传价值的供体母牛重复取卵而获得遗传背景清楚的优质胚胎，充分挖掘优良母畜的遗传潜力；可对幼畜进行取卵，缩短世代间隔，加速养牛业的遗传育种改进；也适用于有生殖道疾患或对超排反应不敏感的供体母牛，使母畜资源得以充分利用；同时，还可为胚胎研究提供大量试验材料，促进相关胚胎工程技术的发展。所以，从二十世纪九十年代中末期，以OPU为卵源的胚胎生产的比例正逐步上升。
活体取卵的方案有许多种，从取卵的频率上主要分为一周一次和一周两次。虽然在短期固定时间内，一周两次可获得较多卵母细胞，但对供体母牛损伤较重。因此若长期取卵，还是以一周一次为主。目前，国际上通常的取卵方案是长期连续的一周一次。但长期连续的一周一次取卵仍会对供体母牛造成一定的负面影响，尤其是引起供体母牛发情周期特征的改变和繁育能力下降，极大地限制了活体取卵技术的推广应用。因此有必要对OPU供体牛的负面影响等进行研究，选出最佳的取卵方案，一方面，减少穿刺对供体母牛的负面影响，充分发挥活体取卵的优势；另一方面在数量和质量上保证卵母细胞的来源，为后续的相关胚胎研究和胚胎体外生产奠定基础。
发明内容
本发明的目的即在于提供一种新型的牛卵母细胞的活体取卵技术，其能够在获得一定数量和质量卵母细胞的同时，又减少活体取卵对供体母牛的负面影响。
本发明通过对母牛发情特征(兴奋性，发声，外阴红肿，粘液分泌，趴跨)的观察研究，将活体取卵(OPU)操作固定在发情周期的第3天和第10天，而发情周期的后半段不进行OPU操作；在下一个发情周期的第3天和第10天再进行OPU操作，如此周而复始地循环操作。
经与国际上常用的长期连续的一周一次取卵的方式进行比较，本发明的牛卵母细胞的活体取卵技术(间断的一周一次取卵方案)具有以下优点1)在相同的取卵时间，间断的一周一次取卵方案所需的穿刺较少，一方面可节约取卵实验成本，另一方面可减少对供体母牛的损伤。
2)在相同的取卵时间，回收的卵母细胞的质量和数量上，两种方案相似，为后续的胚胎体外生产技术的研究和应用奠定基础。
3)对供体母牛的负面影响上，间断的一周一次取卵方案显著较小，保证活体取卵的长期性和可持续性。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，将本发明的活体取卵(OPU)方法与现有技术的方法在同等条件下作比较，以进一步说明本发明的技术特点与优势。
整个实验分3个时期前OPU期(pre-OPU)，所有奶牛都经过两个连续发情周期的观察，以确定发情周期；OPU期，进行连续或间断的OPU操作，持续20周；后OPU期(post-OPU)，观察OPU操作后的1个发情期特征后，对所有奶牛即开始人工输精配种，直至配上为止。
实施例1、OPU操作本发明所使用的实验试剂，除另有说明的外，均为美国Sigma公司的产品。
本实施例所使用的母牛选已建立发情周期的青年荷斯坦奶牛，开始实验时年龄为12-13个月，体重和体况相似。
取10头青年荷斯坦奶牛，随机分成2组，每组5头，第一组采用本发明的每个发情周期内只在第3天和第10天取卵的方法，以下称为间断方案组(discontinuous schemes，DCS)；第二组采用现有技术中所通用的连续一周一次的取卵方法，称为连续方案组(continuous schemes，CS)。
活体取卵的方法参考Petyim SR等(Petyim SR，et al.J.Vet.Med.A.Physiol.Pathol.Clin.Med.2000，47627-640)的方法略作改进，具体操作如下将母牛站立保定，消毒麻醉。全过程在B型超声监视下进行。将带有采卵针的探头轻缓插到阴道穹隆，操作人员通过直肠隔着直肠壁将卵巢牵引至B超探头端部，推进采卵针，同时，用脚踏开关控制真空泵抽吸卵泡液，压力在95mmHg左右。之后，用杜氏磷酸缓冲液(DPBS，1升去离子水中含8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4、30g BSA和2000u肝素)冲洗采卵针和导管，冲洗液也一同放入收集管。所有≥2mm的卵泡均被穿刺。记录穿刺的次数以及穿刺卵泡的数量。
将收集液倒入拣卵杯中，用DPBS冲洗，拣出卵母细胞移入培养皿，记录回收的卵母细胞的数量。
持续20周以后，根据穿刺的次数以及穿刺卵泡的数量计算每头每次的穿刺卵泡的平均数量；同时根据回收的卵母细胞的数量计算回收率以及每头每次的卵母细胞的平均数量，结果如表1所示。
表1、两种技术方案中穿刺卵泡及回收卵母细胞的数量特征
每行数字有不同上标字母者有显著性差异(P＜0.05)
由以上表1的结果可见，与连续方案组(CS)相比较，本发明的间断方案组(DCS)中穿刺卵泡的总数虽然相对较少，但每头每次穿刺的平均数却增加了。
两种方案所回收的卵母细胞的总数相似，但从每头每次回收的卵母细胞的平均数量来看，DCS方案组要显著高于CS方案组，回收率也较高。
实施例2、卵母细胞的分级取回收的卵母细胞，在体视显微镜下观察以进行质量分级，分级的具体标准如下A级卵母细胞胞质均匀，至少5层以上卵丘细胞致密排列在卵母细胞周围；B级卵母细胞胞质均匀，含1-5层卵丘细胞；C级，卵母细胞胞质均质度差或半裸或全裸或卵丘扩散卵。
根据以上标准对卵母细胞进行分级的结果如以下表2所示表2、卵母细胞质量分级
由以上表2的结果可见，DCS方案组与CS方案组的卵母细胞的质量级别相似。
实施例3、卵母细胞的体外成熟、体外受精及体外培养3.1、卵母细胞的体外成熟把拣出的卵母细胞用成熟液(TCM-199(Gibco，Grand Island，NY)外加10％胎牛血清(FBS)、10μg/ml促黄体生成激素、1μg/ml雌二醇和1μg/ml促卵泡生成素)洗3～5遍后，进行体外成熟培养。培养条件为5％CO2，38.5℃，饱和湿度。培养23～24h。
3.2、卵母细胞的体外受精将体外培养成熟的卵母细胞用受精液(BO液+20μg/ml肝素)洗涤5次，然后按10～20个/滴移入预温2小时的受精液微滴中。
其中BO液的配制如下BO液 mg/1000mlNaCl655.0KCl 30.0NaH2PO4·H2O11.3MgCl2·6H2O 10.6
CaCl2·2H2O 0.3308D-Glucose 250.0Penicillin 500IUStreptomycin125NaHCO33104丙酮酸钠55青霉素G钾 31BSA 3mg/ml1％酚红 0.02冻精细管从液氮中取出后，迅速投入38℃的水浴中，解冻后，用洗精液(BO液+1.955mg/ml咖啡因)快速离心洗涤(12000rpm，10s)，弃上清，重复一次，然后小心加入受精液，置CO2培养箱上浮20～30min，吸取一定量的上浮液加入受精微滴中，使精子的最终密度约为1×106个/ml。置CO2培养箱精卵共孵育6～8小时。
3.3、受精卵的体外培养受精卵共培养6～8小时后，将受精卵用体外培养液(TCM199+10％FBS+0.12g/ml丙酮酸钠)洗3～5遍，当中用吸胚管吹打去除受精卵周围的卵丘细胞。将受精卵按10～20个/50μl移入在CO2培养箱预温好的体外培养滴(用体外培养液在培养皿内做50μl的悬滴，覆盖石蜡油)。每隔48h半量更换培养液。培养条件为5％CO2，38.7℃，饱和湿度。受精后48h计算卵裂率(卵裂胚胎数/培养胚胎数)，第8天计算囊胚率(囊胚数/培养的胚胎数)，结果以下如表3所示表3、卵裂率与囊胚率的比较
由表3的结果可见，两种方案(DCS方案组与CS方案组)的卵裂率与囊胚率相似。说明两者具有相近的体外发育能力。
实施例4、发情观察分别对两种方案组(DCS和CS方案组)的奶牛的发情情况进行观察，一天观察三次，根据发情特性(兴奋性、发声、外阴红肿、粘液分泌、趴跨)量化发情表现，具体为0＝无发情；1＝不确定；2＝弱发情；3＝强发情。观察的结果如以下表4所示
表4、在前OPU期、OPU和后OPU期的发情周期特征
同一方案中每行数字有不同上标字母者有显著性差异(P＜0.05)由以上表4的结果可见，在前OPU期所有奶牛均显示完全正常的发情周期特征。OPU期，CS中，周期个数减少，周期长度出现逐渐延长的趋势(P＜0.05)，发情程度减弱(P＜0.05)；DCS中，各特征则与前OPU期无显著区别。后OPU期，DCS中各奶牛仍表现正常，CS中，周期长度基本恢复，但发情程度仍减弱(P＜0.05)。
实施例5、繁育能力-人工输精配种结果对所有奶牛在OPU后的第一个发情期即开始人工输精配种，直至配上为止，计算各组每头牛所需的平均配种次数。DCS组的5头牛共配种6次，每头牛所需的平均配种次数为1.2±0.2；而CS组的5头牛共配种11次，每头牛的平均配种次数为2.2±0.4(Mean±SE，p＜0.05)。可见，DCS组的平均配种次数明显低于CS组。
综上所述，与现有技术中通用的长期连续一周一次的取卵方法相比，在长期的活体取卵中，相同时间内，回收的卵母细胞的质量和数量上，本发明的固定在发情周期的第3天和第10天取卵的方法与连续一周一次的取卵方法相似，但是本发明的方法所需的穿刺较少，对供体母牛的负面影响明显较小；这一方面可以节约取卵实验的成本，另一方面可以减少对供体母牛的损伤，解决了活体取卵在获得卵母细胞的同时又影响供体母牛的矛盾，保证活体取卵的长期性和可持续性，从而有利于此项技术的推广应用。
一头高产优质奶牛，在其出生时卵巢中约有15万个卵泡，如果通过通常的繁育手段，充其量只能利用它的十几枚卵泡。但如果应用本发明的固定在发情周期的第3天和第10天取卵的方法进行活体取卵，则可持续不断取得优质的卵母细胞，进行胚胎体外生产，从而获得优良遗传性状的牛犊。因此，本发明将促进活体取卵技术在农牧业学和发育生物学上的应用，促进家畜良种繁育和胚胎学研究。
权利要求
1.一种牛卵母细胞的活体取卵方法，其特征在于，在母牛发情周期的第3天和第10天进行活体取卵操作，发情周期的后半段不进行取卵操作；在下一个发情周期的第3天和第10天再进行活体取卵操作，如此周而复始。
2.如权利要求1所述的活体取卵方法，其特征在于，首先确定供体母牛的发情时间。
全文摘要
本发明公开了一种牛卵母细胞的活体取卵方法，首先确定供体母牛的发情时间，然后分别在母牛发情周期的第3天和第10天对母牛进行活体取卵操作，发情周期的后半段则不进行取卵操作，如此周而复始。本发明的牛卵母细胞的活体取卵方法与国际上常用的长期连续的一周一次取卵的方式相比，不仅可节约取卵实验成本，而且可减少对供体母牛的损伤。在对供体母牛的负面影响上，本发明的牛卵母细胞的活体取卵方法显著较小，从而保证了活体取卵的长期性和可持续性。
文档编号A61D19/02GK1806773SQ200510023510
公开日2006年7月26日 申请日期2005年1月21日 优先权日2005年1月21日
发明者曾溢滔, 黄淑帧, 杨晓煜, 李华 申请人:上海交通大学附属儿童医院, 上海滔滔转基因工程股份有限公司