专利名称：一种用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的方法
技术领域：
本发明涉及用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的方法。
背景技术：
膜翅目昆虫在农林重要害虫的生物防治方面正发挥着不可替代的重要作用。截至2001年，全世界引进天敌成功控制农林害虫的情况为蚜小蜂科90例，茧蜂科53例，姬小蜂科23例，姬蜂科22例，金小蜂科17例，缨小蜂科9例，其他科共15例。以上所有生物防治的成功实例都是建立在这些寄生蜂在自然界就是寄生其特定的寄主的。这是生物进化过程中所建立起来的。
昆虫利它素是指由一种昆虫分泌并释放到体外引起异种昆虫个体产生行为反应的化学物质，并且该行为反应对接受者有利。利它素在寄生蜂的寄生行为中，主要起寄主定位、寄主识别和刺激产卵等重要作用，对捕食性昆虫主要起搜寻猎物的作用。这是寄生蜂之所以寄生其天然寄主的原因。充分利用这一关键因子，将有助于建立一套全新的寄生蜂与寄主间的关系，打破传统寄生方式。
野蚕黑卵蜂(Telenomus theophila Wu et Chen)属膜翅目(Hymenoptera)缘腹细蜂科(Scelionidae)，是野蚕卵期的优势寄生天敌，具有搜寻能力强、寄主专一、产卵量高等优点，目前在室内已经解决了大量繁殖的技术难题，可做到全年持续繁殖。高其康等研究发现，野蚕黑卵蜂对解剖来自桑蚕侧输卵管的卵的接受率(野蚕黑卵蜂表现出探查和钻入行为)，远小于对野蚕或桑蚕雌蛾自然解剖卵的接受率，表明自然解剖卵的表面存在能被野蚕黑卵蜂识别的物质。进一步研究发现，这种物质来源于野蚕或桑蚕雌蛾的性附腺中，定名为野蚕黑卵蜂寄主识别利它素。测定野蚕黑卵蜂对不同形状并涂有野蚕黑卵蜂寄主识别利它素的锡球(人造卵)的反应级数表明，涂有野蚕黑卵蜂寄主识别利它素的锡球(人造卵)能强烈地诱导野蚕黑卵蜂对其产生寄生行为，这一结果为本发明提供了物质基础，为扩展野蚕黑卵蜂寄主范围的提供了必要条件。
马尾松(Pinus massoniana Lamb.)属松科松属油松派(组)，全树皆可利用，经济效益较高，对气候适应性强，对土壤要求低，生长迅速，是植树造林的好树种。广泛分布于秦岭、淮河以南，云贵高原以东的17个省自治区、直辖市，面积约200万KM2，居全国针叶林首位，蓄积居全国第四位。
马尾松毛虫Denduolimus punctatus(Walker)，属鳞翅目(Lepidoptera)枯叶蛾科(Lasiocampidae)松毛虫属(Dendrolimus)，主要危害马尾松，还可危害湿地松、火炬松等。在我国森林害虫中，马尾松毛虫的危害面积最大，经常猖獗成灾。而且，人体接触松毛虫毒毛后，易引起皮炎及关节肿痛，既影响林业生产，又危及人身健康。该虫主要分布于华东、华中、西南、华南等地，南北跨15个省区。一年发生2-4代，发生世代的多少随不同地区而异。松树被害后，轻者造成材积损失，松脂减产，种子产量降低；重者针叶被吃光，形如火烧，造成松树枯死，导致松墨天牛、松白星象鼻虫、松小蠹虫等蛀干害虫大发生，以致松林大面积死亡。同时松毛虫具毒毛，人体接触容易引起皮肤痒、皮炎、关节肿痛，严重时会致残等疾病，影响人民身体健康。如广东省五十年代至六十年代初，发生面积较小；自1964年开始，发生面积不断扩大，危害程度日趋严重；据统计，自1964年至1991年，平均每年马尾松毛虫发生面积达300万亩以上，最严重的是1988年和1991年，其中1988年发生面积880万亩；1991年发生面积1825万亩次，实际发生面积998万亩，按针叶损失率50％以上，面积约为500万亩，每亩损失木材0.1立方米计，1991年损失木材50万立方米，经济损失近1.5亿元，按受灾面积中产脂面积约150万亩，每亩损失松脂30公斤计，1991年损失松脂4.5万吨，经济损失500万元；据1991年统计，防治松毛虫面积约1212万亩次，投入防治经费约2000万元。由此广东省在1991年因松毛虫灾害造成直接经济损失2亿元以上。
马尾松毛虫在自然界的寄生性天敌有①寄生蜂主要的种类有松毛虫黑卵蜂、毒蛾黑卵蜂、松毛虫赤眼蜂、平腹小蜂，这些小蜂寄生在松毛虫卵。两色姬蜂，大腿蜂、红头小茧蜂、日本瘤姬蜂、黑胸姬蜂、花胸姬蜂主要寄生幼虫和蛹；据调查，马尾松毛虫寄生蜂45种。②寄生蝇主要的种类有松毛虫狭颊寄蝇，蚕饰腹寄蝇、伞裙追寄蝇、家蚕追姬蝇等。主要寄生老熟幼虫和蛹。马尾松毛虫的数量消长与天敌的关系极为密切。上述寄生性天敌要利用并应用于生物防治的话，必须解决寄生性天敌的大量繁殖问题，这是寄生天敌应用于生物防治的最大瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的方法，应用本发明方法可增加马尾松毛虫的寄生天敌，拓展野蚕黑卵蜂的寄生寄主范围，为进一步建立马尾松毛虫新的生物防治途径提供有力的技术支撑。
本发明的用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的方法，包括以下步骤1)从桑树枝杆上采集野蚕卵，置培养箱内培养，获得野蚕黑卵蜂；
2)解剖野桑蚕或桑蚕雌蛾性附腺的贮存部，从贮存部的分泌物中分离收集野蚕黑卵蜂寄主识别利它素；3)采集马尾松毛虫雌蛾的解剖卵，在马尾松毛虫解剖卵表面涂上野蚕黑卵蜂寄主识别利它素，凉干；4)用经交配的野蚕黑卵蜂雌蜂寄生步骤3)的马尾松毛虫解剖卵，放入培养箱内培养，直至马尾松毛虫解剖卵中羽化出野蚕黑卵蜂。
本发明所指的野蚕黑卵蜂形态特征符合1980年吴燕如等在动物分类学报第5卷第1期第79至83所描述的特征。
本发明所指的马尾松毛虫属鳞翅目、枯叶蛾科、松毛虫属，成虫形态的特征体色有灰白、灰褐、茶褐、黄褐等色。雌蛾体色比雄蛾浅。雄蛾体长20-28mm，翅展36-39mm，触角羽状，体一般茶褐到黑褐色，前翅横线色深，明显，中室白斑显著，亚外缘黑斑内侧褐色，腹部细削，末端尖。雌蛾体长18-29mm，翅展42-57mm，触角短栉状。体、翅密被灰褐色鳞片、呈灰褐色、前翅中室白斑不明显，前翅具5条深色横线，外横线略呈波浪状纹，亚外缘斑列8-9个黑褐色，内侧衬以淡棕色斑，腹部粗壮、末端圆。
本发明能用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的特征是寄生涂有野蚕黑卵蜂寄主识别利它素的马尾松毛虫解剖卵时，所用的野蚕黑卵蜂雌蜂必须已经与野蚕黑卵蜂雄蜂自然交配过。
本发明中用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂所用的野蚕黑卵蜂雌蜂其数量不限定。通常，为获得更多的野蚕黑卵蜂，可将步骤1)获得野蚕黑卵蜂在室内进一步用桑蚕卵繁殖。即采集桑蚕雌蛾的解剖卵作为野蚕黑卵蜂繁殖用的寄主卵，将桑蚕卵放入含步骤1)获得的野蚕黑卵蜂容器中，供野蚕黑卵蜂寄生，繁殖野蚕黑卵蜂。
本发明用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的生化培养箱的培养最佳温度25±1℃，相对湿度为75±10％。
本发明的优点是1.采用本项发明的方法，可以使自然条件下不能寄生马尾松毛虫解剖卵的野蚕黑卵蜂能寄生，从而扩大野蚕黑卵蜂繁殖所用的寄主范围，为进一步成功控制马尾松毛虫对马尾松的危害创造了新的途径。在实际应用中有其巨大潜力。一旦把本发明应用于防治马尾松毛虫，由于野蚕黑卵蜂能在实验条件下大量繁殖的优点，即能解决因寄生蜂无法大量繁殖而导致的无法应用的难题，大大减少化学农药及其他微生物的使用量，保护自然环境的可持续平衡发展，有效地控制害虫的发生，其经济和社会效益均将是巨大的。
2.具有较高的科学研究价值。本项发明打破了自然条件下寄生蜂与寄主间的对应关系，把原来不能寄生的非寄主转变成能寄生的寄主，扩大了野蚕黑卵蜂的寄生范围，开创了害虫生物防治的新方法和新途径。
具体实施例方式
实施例1)桑蚕卵的准备将从桑蚕蛹羽出后3-5小时的雌和雄成蛾经交配，交配时间2-5小时左右分开，放在一牛皮纸的糙面上并盖上一报纸避光，待基本产满卵时，更换牛皮纸，让这些蛾继续产卵。同时将产出的卵卡剪裁分开后，立即放入-20℃冰箱内保存，作为野蚕黑卵蜂繁蜂用的寄主卵。
2)野蚕黑卵蜂采集冬季在有野桑蚕发生的桑园中的桑树枝杆上，采集野蚕卵。将采集的野桑蚕卵装在寄生蜂收集瓶内。一端(大口端)用3层沙布封口，另一端(小口端)接一干净玻璃试管并朝向阳处，室温放置。待野蚕黑卵蜂羽出后，每天更换接蜂试管，将换下试管内的野蚕幼虫用毛笔引出，再将各管的野蚕黑卵蜂并在一起，使每管的蜂数为50～100头左右。取一小块棉花，沾20％蜂蜜稀释液后，小心地贴在已接蜂管壁上，供新羽出野蚕黑卵蜂取食，然后将试管口用四层纱布封住并每天更换沾蜂蜜的棉花。
3)野蚕黑卵蜂的进一步繁殖野蚕黑卵蜂羽化第二天的上午，将上述步骤1)的桑蚕卵放入含野蚕黑卵蜂的玻璃试管中，供野蚕黑卵蜂寄生。当天下午，取出各管内的已寄生桑蚕卵卡(小心不让野蚕黑卵蜂跑出试管)，然后将这些卵卡放入干净玻璃试管内，并在管壁上粘一小块用水湿润的棉花(以挤不出水为宜)。再用四层纱布封口，并用记号笔记在管壁上记上“野蚕黑卵蜂”及其代数和当天日期。注意，每管羽出蜂寄生次数以3次为宜。将作好标记的各管寄生卵置于生化培养箱内。培养箱的条件为温度为25±1℃，相对湿度为75±10％，14小时光照，10小时黑暗，光照强度800Lux。每天保持各管内棉花的湿度，并观察寄生卵的颜色变化情况，直寄生卵中羽化出新一代野蚕黑卵蜂。这些蜂可继续重复扩大培养。也可作为寄生马尾松毛虫解剖卵的蜂。
4)野蚕黑卵蜂寄主识别利它素的提取和保存取刚羽化的桑蚕雌蛾，在冰台上解剖，取得性附腺，用剪刀将性附腺从贮存部和分泌部交界处剪开，然后，一手用镊子夹住贮存部近分泌端，悬在1.5mL离心管上，另一手用剪刀剪开贮存部近中输卵管的会和处，使贮存部内的附腺分泌物自然流入离心管中，在收集的附腺分泌物中加入等体积灭菌无离子水，混匀后8000转/分钟离心5分钟，收集上清液，分装在离心管内，每管0.25mL，于-70℃保存或直接用于7)。
5)马尾松毛虫解剖卵采集在马尾松毛虫发生区采集活的马尾松毛虫茧，用刀削出马尾松毛虫蛹，放于内含吸水纸的培养皿中，待马尾松毛虫成虫羽出，用解剖刀从雌成蛾腹部取出卵巢，放入一干净的烧杯中，加入生理盐水，充分搅动以破卵巢膜，静止片刻，这时成熟卵会优先沉入杯底。倒去上层液体，再加入生理盐水，充分搅动，再去上层液体。这样反复几次，直到获得马尾松毛虫解剖卵。
6)马尾松毛虫解剖卵的野蚕黑卵蜂寄主识别利它素处理取上述步骤4)的蚕黑卵蜂寄主识别利它素，用灭菌无离子水稀释4倍。将上述步骤5)获得的马尾松毛虫解剖卵放入野蚕黑卵蜂寄主识别利它素溶液中，用镊子逐一从野蚕黑卵蜂寄主识别利它素溶液中镊出马尾松毛虫解剖卵置与干净的牛皮纸上，室温中凉干制成经野蚕黑卵蜂寄主识别利它素处理过的马尾松毛虫解剖卵卡。
7)马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂将上述步骤2)或3)中的野蚕黑卵蜂引入干净的玻璃试管内，再将上述步骤6)准备好的马尾松毛虫解剖卵卡放入有野蚕黑卵蜂玻璃试管内，供野蚕黑卵蜂寄生，用四层纱布封口。寄生4小时后取出该寄生卵卡，放入生化培养箱内。培养箱的最佳条件为温度为25±1℃，相对湿度为75±10％，14小时光照，10小时黑暗，光照强度800Lux。每天保持各管内棉花的湿度，并观察寄生卵的颜色变化情况，直至马尾松毛虫解剖卵中羽化出新一代野蚕黑卵蜂。
权利要求
1.一种用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的方法，包括以下步骤1)从桑树枝杆上采集野蚕卵，置培养箱内培养，获得野蚕黑卵蜂；2)解剖野桑蚕或桑蚕雌蛾性附腺的贮存部，从贮存部的分泌物中分离收集野蚕黑卵蜂寄主识别利它素；3)采集马尾松毛虫雌蛾的解剖卵，在马尾松毛虫解剖卵表面涂上野蚕黑卵蜂寄主识别利它素，凉干；4)用经交配的野蚕黑卵蜂雌蜂寄生步骤3)的马尾松毛虫解剖卵，放入培养箱内培养，直至马尾松毛虫解剖卵中羽化出野蚕黑卵蜂。
2.根据权利要求1所述的用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的方法，其特征是将步骤1)获得野蚕黑卵蜂在室内用桑蚕卵进行繁殖。
3.根据权利要求1所述的用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的方法，其特征是步骤1)和4)所说的培养箱内培养的温度为25±1℃，相对湿度为75±10％。
全文摘要
本发明公开了一种用马尾松毛虫解剖卵繁殖野蚕黑卵蜂的方法。该方法是利用从桑蚕或野桑蚕雌蛾性附腺中分离得到的野蚕黑卵蜂寄主识别利它素应用于马尾松毛虫解剖卵，使得野蚕黑卵蜂能寄生在自然界中不能寄生的马尾松毛虫解剖卵，并能在马尾松毛虫解剖卵内完成整个发育过程，直到从马尾松毛虫解剖卵中羽出野蚕黑卵蜂。从马尾松毛虫解剖卵中羽出野蚕黑卵蜂仍能进行世代繁殖。本发明方法有望挖掘野蚕黑卵蜂的寄生潜力，开发成为马尾松毛虫的又一天敌，为马尾松林的长期保护，达到可持续发展作出贡献，为进一步成功控制马尾松毛虫对马尾松的危害创造了新的途径。
文档编号A01K67/00GK1545872SQ20031010944
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者高其康, 楼兵干, 韦国栋, 胡萃 申请人:浙江大学