专利名称：一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种杂交稻种子的生产方法，特别是一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法。
背景技术：
水稻是全球近一半人的主食。全球每年被病虫草害夺走大约三分之一。据估计，造成的经济损失每年达1200万美元以上。为了对付病虫草害，每年还要生产大约200多万吨的农药。例如二化螟和稻飞虱是北方稻田的两大主要虫害，每年可使水稻减产10％-20％，严重者还会造成绝收。当前防治虫害的主要措施是大量使用杀虫双和呋喃丹等杀虫剂，每年的用量可达1000万公斤以上，价值在2000万元左右，不仅造成人力和财力的浪费，而且还造成环境污染，随着时间的推移，农药的残毒、害虫的抗药性也会日益突出，当今在推广杂交稻种植中同样遇到上述虫害问题，还遇到杂交稻种不纯的问题，二者严重制约了杂交稻的推广与应用。即抗虫性差，不能确保稳产高产；稻种不纯，不宜大面积种植。这两个问题难以用常规育种方法有效解决，如在杂交稻制种中极易引起生物学和机械性混杂，尤其是两系杂交稻的自身混杂。为此，人们在探索其解决方法并取得了成果，如中国专利申请号99115125.9申请文件中涉及到了将抗除草剂基因导入三系杂交稻保持系以使其系获得抗除草剂基因，使之具备抗除草剂特性。又如中国专利申请号97109814.X文件中涉及到将抗除草剂基因转入三系或二系杂交稻恢复系，使之获得抗除草剂基因，具备抗除草剂特性，以保在培育中用除草剂除草时只除掉草，而不伤害杂交稻苗，以生产出纯度高的稻种，在这两申请案中均未涉及杂交稻制种导入抗除虫剂基因的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法，既能克服杂交稻种子因纯度不够大而不能大面积生产的问题，又能增强杂交稻的抗虫性，提高产量。
本发明的技术方案是将抗除草剂基因和抗螟虫基因转入三系杂交稻或两系杂交稻的恢复系，使恢复系获得抗除草剂基因和抗二化螟基因，具备抗除草剂和二化螟特性；将抗稻飞虱基因转入三系杂交稻的保持系，使保持系获得抗稻飞虱基因，具备抗稻飞虱特性；通过不育系与保持系杂交，使不育系获得抗稻飞虱基因，具备抗稻飞虱特性；再利用所得到的恢复系与不育系杂交，生产杂交稻种子。也就是说将抗稻飞虱的雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis agglutinin，GNA)基因导入到杂交稻的保持系早花二B中，以抗潮霉素(Hygromycinphosphotransferase，Hyg)基因作为筛选标记基因；将修饰后的抗螟虫的豇豆胰蛋白酶抑制剂(modified cowpea trypsin inhibitor，modifiedCpTI＝SCK)基因导入到杂交稻恢复系超优一号中，以抗除草剂Basta的bar基因作为筛选标记基因，同时也作为目的基因。这样在不育系的繁种过程中，不育系早花二A就获得了抗稻飞虱特性；通过杂交稻制种过程，杂交稻就获得了亲本中的两种抗虫性和抗除草剂特性。
多抗转基因杂交粳稻的组配亲本1转基因恢复系转化的基因1.1抗二化螟基因目的基因。所用SCK基因为修饰后的豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea trypsin inhibitor，CpTI.Modified CpTI＝SCK)基因，来源于栽培豇豆品种加利福尼亚黑眼豆(Vigna unguiculata L.Walp，cv.CaliforniaBlack-eye)，是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一种，属于Bowman-Birk类型的双头蛋白酶抑制剂，即一个抑制剂分子可以抑制两个胰蛋白酶分子的催化活性(Hilder，V.A等人，1989)。CpTI主要存在于豇豆的可食部分种子内，属于白蛋白类型的种子贮藏蛋白。CpTI基因在种子灌浆早期开始表达，并迅速合成CpTI，最终成熟种子内CpTI的含量可达总蛋白含量的10％左右(Hilder，V.A等人，1990)。
目的基因序列全长415bps，编码136个氨基酸和一个终止密码子，前端为25氨基酸的内质网定位信号Signal，末端为4氨基酸的内质网滞留信号KDEL，中间为324bps的CpTI基因，编码107个氨基酸残基。其中包括27个氨基酸前导肽序列和80个氨基酸的成熟蛋白序列。
SCK基因引物序列5′5′-AAA ATC AAG AGC ACC ATC TTC 3′3′5′-TCT AGA GTT CAT CTT TCT CAT C 3′1.2抗除草剂基因标记基因和目的基因。它是从吸水链霉菌(StrepTomyceshygroscopicus)中分离出来的抗PPT(Phosphinotricin)的bar基因，PPT是一种谷氨酰胺合成酶的抑制剂，一般认为植物体内生成的PPT会抑制谷氨酰胺合成酶导致氨积累，最后使植物因氨累积而中毒死亡。bar基因编码乙酰转移酶PAT(Phosphinotricin acetyltransferase)，PAT使乙酰与PPT的游离氨基结合，并使PPT失去活性，不能抑制谷氨酰胺合成酶。因此，可提供对PPT的抗性。bar基因编码乙酰转移酶PAT，主要存在于植物的叶子部分，在植物的籽粒部分不表达。
bar基因引物序列5′5′-TCA AAT CTC GGT GAC GGG C 3′3′5′-CAC CAT CGT CAA CCA CTA C 3′2、转基因保持系转化的基因2.1抗稻飞虱基因目的基因。所用基因为雪花莲外源凝集素(galanthus nivalisagglutinin，GNA)基因，来源于雪花莲。雪花莲(galanthus nivalis)属于石蒜科(wmarvillidaceace)观赏植物，在雪花莲一定生长阶段的大多数组织中含有GNA，GNA只专一识别并结合α-1，3和α-1，6甘露糖。外源凝集素的毒性基于它们特异结合到昆虫肠道的糖缀合物上，这种结合影响了营养物质的正常吸收(powell，1993；van damme，1988).另外，还有研究报道，外源凝集素可促进昆虫消化道内细菌繁殖，并诱发病兆(liener，1986)，最终对害虫造成严重危害，抑制害虫生长繁殖，从而达到杀虫的目的。
目的基因序列全长484bps，编码157个氨基酸和两个终止密码子，N-端为23氨基酸的信号肽，末端为29氨基酸的C-端序列，中间编码105个氨基酸的成熟蛋白。
GNA引物序列为5′5′-CAA AAT GGC TAA GGC AAG TC-3′3′5′-CGG TCA TTA CTT TGC CGT CA-3′2.2抗潮霉素基因标记基因。为潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin Bphosphotransferase，hyg)基因，又称aph(4)-Ta或hpt，hph基因，来自streptomyces hygroscopicus(Gritz，L.& Davies，J.，1983)。aph(4)-Ta编码氨基酸糖苷4-磷酸转移酶[APH(4)-Ta]，又称潮霉素磷酸转移酶。潮霉素B可抑制蛋白质的合成，APH(4)-Ta可将ATPXa-位磷转移至潮霉素B的第4位羟基上，并使其失去抑制活性。因此，其可提供对潮霉素的抗性。
以上基因的转化方法为基因枪轰击法。
3、转基因不育系转化的基因抗稻飞虱基因和抗潮霉素基因，由转基因保持系繁殖获得。
多抗转基因杂交粳稻的组配方法1、转基因不育系的繁种过程如图所示普通不育系×转基因保持系(含GNA基因)↓(抗稻飞虱)↓转基因不育系(含GNA基因)(抗稻飞虱)2、多抗转基因杂交粳稻的制种过程如图所示转基因不育系×转基因恢复系(含GNA基因)↓(含SCK、bar基因)(抗稻飞虱)↓(抗二化螟，抗除草剂)↓多抗转基因杂交粳稻(含有SCK、GNA、bar三个外源基因)(抗二化螟，抗稻飞虱，抗除草剂)多抗转基因杂交粳稻的组配优点1、应用本发明的方法，只要随机取样播种，苗期喷施除草剂Basta，一个星期之内就能简便、精确地统计出每一批制种杂交稻的纯度，鉴定时间短，鉴定效率高。
2、应用本发明的方法生产的杂交稻种子在播种秧田期可通过喷施除草剂Basta及时把假杂种清除掉，同时还可消灭杂草，从而提高生产田的纯度，更好地体现杂种优势。
3、应用本发明的方法生产的杂交稻种子具有抗二化螟和抗稻飞虱的特性，可以抵抗螟虫和稻飞虱的危害，提高水稻产量，而且因大量减少了农药的使用而节省了费用，减轻了农药对益虫的杀害和对产品产生的毒害(残留)，同时也保护了环境。因此种植抗虫杂交稻比常规杂交稻能获得更好的社会效益和更大的经济效益。
4、应用本发明生产的杂交稻可为社会提供更多的优质、少污染大米。随着我国人民生活水平的不断提高，人们对大米的品质要求越来越高，特别是优质、不被农药污染的稻米将有着极为广阔的市场。杂交稻本身的制种和繁种过程，赋予了杂交稻以广阔的产业化前景。
具体实施例方式
三系法生产杂交稻种子实例1、亲本1.1恢复系1.1.1基因转化受体为天津市水稻研究所选育的优质粳稻恢复系超优一号(又叫津稻1229)。在京津地区栽培全生育期145天，亩产500-600Kg。株高110cm左右，穗大，穗长22cm，平均每穗116粒；粒大，千粒重26-27g，结实率91％。经农业部谷物品质监督、检验测试中心检验，各项指标均达到国家一级优质米标准。
1.1.2转基因恢复系全生育期同转化受体，145天左右。株高115cm左右，穗长26cm左右，平均每穗163粒；千粒重25g左右，结实率81％左右。增加了抗虫性和抗除草剂特性。
1.2保持系1.2.1基因转化受体为天津市水稻研究所选育的优质粳稻保持系早花二B。全生育期160天左右，适于做早、中稻栽培。一般亩产550Kg。茎秆矮壮、坚硬，抗倒力强。株高85cm左右，棒状穗，着粒较密。平均每穗135粒左右，穗长17cm左右，结实率94％，粒型椭圆，千粒重23g。无芒或有短顶芒。
1.2.2转基因保持系全生育期同受体材料。株高90cm左右，比受体稍高些；穗型比受体稍散一些，其他性状同受体。增加了抗稻飞虱和潮霉素特性。
1.3不育系1.3.1转基因转化受体为天津市水稻研究所选育的优质粳稻不育系早花二A。全生育期160天左右。茎秆矮壮、坚硬，抗倒力强。株高85cm左右，棒状穗，着粒较密。平均每穗130粒左右，穗长16cm左右，自交结实率为0，异交率30％左右，粒型椭圆，无芒或有短顶芒。
1.3.2转基因不育系由转基因保持系进行繁殖。其生育期及其他农艺性状同早花二A。自交结实率为0。异交率30％左右。增加了抗稻飞虱和潮霉素特性。
2、组配方法
2.1转基因不育系的繁种过程如图所示普通不育系早花二A×转基因保持系T早花二B(含GNA基因)↓ (抗稻飞虱)↓转基因不育系T早花二A(含GNA基因)(抗稻飞虱)2.2多抗转基因杂交稻的制种过程如图所示转基因不育系T早花二A×转基因恢复系T超优一号(含GNA基因) ↓ (含SCK、bar基因)(抗稻飞虱) ↓ (抗二化螟，抗除草剂)↓多抗转基因杂交粳稻组合(含有SCK、GNA、bar三个外源基因)(抗二化螟，抗稻飞虱，抗除草剂)3、除草剂处理结果
权利要求
1.一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法，其特征在于将抗除草剂基因和抗螟虫基因转入三系杂交稻或两系杂交稻的恢复系，使恢复系获得抗除草剂基因和抗二化螟基因，具备抗除草剂和二化螟特性；将抗稻飞虱基因转入三系杂交稻的保持系，使保持系获得抗稻飞虱基因，具备抗稻飞虱特性；通过不育系与保持系杂交，使不育系获得抗稻飞虱基因，具备抗稻飞虱特性；再利用所得到的恢复系与不育系杂交，生产杂交稻种子。
2.根据权利要求1所述的一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法，其特征在于其抗草剂基因为是bar基因。
3.根据权利要求1所述的一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法，其特征在于其抗螟虫基因是SCK基因(修饰后的CpTI，豇豆胰蛋白酶抑制剂基因)。
4.根据权利要求1所述的一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法，其特征在于其抗稻飞虱基因是GNA基因(雪花莲外源凝集素基因)。
5.根据权利要求1所述的一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法，其特征在于其三系杂交稻的转基因不育系是T早花二A系，由表现抗稻飞虱的转基因保持系T早花二B繁育获得。
6.根据权利要求1所述的一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法，其特征在于其转基因恢复系是表现抗Basta的T超优一号。
7.根据权利要求1所述的一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法，其特征在于其转化方法可以是基因枪轰击法。
全文摘要
本发明披露了一种多抗转基因杂交稻种子的生产方法，将抗除草剂基因和抗螟虫基因转入三系杂交稻或两系杂交稻的恢复系，使恢复系获得抗除草剂基因和抗螟虫基因，具备抗除草剂特性和抗二化螟特性；将抗稻飞虱基因转入三系杂交稻的保持系，使保持系获得抗稻飞虱基因，具备抗稻飞虱特性。通过不育系与保持系杂交，使不育系获得抗稻飞虱基因，具备抗稻飞虱特性；再利用所得到的转基因恢复系与转基因不育系杂交，生产杂交稻种子。该方法可以克服杂交稻纯度偏低、抗虫性偏差的问题。
文档编号A01H1/02GK1625939SQ200310107230
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月8日 优先权日2003年12月8日
发明者李艳萍, 牛芝霞, 牛景, 邹美智, 孙海波, 周维, 朱祯, 邓朝阳, 徐鸿林 申请人:天津市水稻研究所, 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 天津市农业生物技术研究中心