专利名称：二苯醚诱导植物体系统性抗性的利记博彩app
相关申请的交叉参考
本申请要求来自下述三个申请的权益和优先权申请日为2000年2月11日的美国临时申请60/181,933；申请日为2000年2月11日的美国临时申请60/181,707；和申请日为2000年2月11日的美国临时申请60/181,686。发明领域
本发明涉及在植物中诱导抗病性的领域。更明确地说，本发明涉及通过使用一种含有二苯醚的制剂诱导天然地植物抗病性。在某些实施方案中，本发明涉及一种通过在植物体中诱导产生异黄酮而抗击植物病原体的方法。
背景技术：
在大豆中，大豆菌核腐(大豆白腐)引起的损害仅在美国就造成了估计约2千6百万美元的年平均损失。由其它作物疾病，例如突死综合症(链孢菌种类)、褐茎腐病、疫霉菌种类等等，产生的损失显著地增加到每年由大豆白腐引起的估计2千6百万美元的损失之上。
控制大豆白腐和其它大豆疾病的尝试包括使用应用于植物体表面的化合物和生物学控制方法。在致病生物进入生物体之前，这些方法试图阻止它们的生长和发育。虽然这些方法是有效的，但它们的持续时间通常很短而且其效力依赖于环境条件。
控制植物疾病的第二种方法是使用抗病性栽培种。典型地，对这些植物体进行遗传工程，以便产生对致病生物有毒的化合物。然而，这些有毒的化合物通常不会在植物体内自然地产生。虽然这种疾病控制方法很有效，而且与使用喷洒到作物上的化合物这种方法比较，在时间和安全性上有了改进，然而在美国和国外公众对使用了遗传工程的作物的使用具有抵制情绪。
最近，研究者已经致力于一种通过增加植物体的自然防御来控制植物疾病的新方法。植物体天生就以两种方式来抵抗病原体的进攻，即预成障碍物和诱导机制。前者包括物理障碍物和持续表达的防御蛋白。它们主要是阻止最初的病原体进入，并且如果已经有障碍物被破坏的话可以提供降低有害效应的方法。后者只有在受到刺激或预成障碍物被破坏时才被激活。例如，病原体的局部感染导致在感染部位诱导出物理性变化(包括细胞壁木质化和乳突形成)(综述在Kessmann，H.，Staub，T.，Hofmann，C.，Maetzke，T.，Herzog，J.，Ward，E.，Uknes，S.，and J.Ryals.1994.Induction of systemicacquired resistance in plants by chemicals.Annual Review ofPhytopathology 32439-459；Schneider，M.，Schweizer，P.，Meuwly，P.，and J.P.Metraux.1996.Systemic acquired resistance inplants.International Journal of Cytology 168303-340；Sticher，L.，Mauch-Mani，B.and J.P.Metraux.1997.Systemicacquired resistance in plants.Annual Review of Plant Pathology35235-270)。另外，信号转导通路的激活导致植物体内未受感染部位产生系统性抗性(综述于Mauch-Mani，B.，and J.P.Metraux.1998.Salicylic acid and systemic acquired resistance to pathogenattack.Annals Botany 82535-540)。因此，第一次感染使植物体处于抵抗未来侵犯状态下，这类似于人类和其它动物的疫苗接种。可是，重要的是这种系统性抗性是广谱的，是针对广泛的、不同的病原体如真菌、细菌或病毒的，而不仅仅是引起最初感染的病原体。虽然与系统性抗性相关的条件性状态通常是暂时性的，但在一些情况下却是持久性的。条件作用也被称为“引发”、“激活”、“增强”和“感受态”。
至少有两种不同的信号转导通路表现出与系统性抗性有关，尽管两者在使植物体处于抵抗进一步病原体进攻上是相似的。系统性后天抗性(SAR)的特征在于植物体组织内水杨酸(SA)的积聚，以及一类叫做病理相关蛋白(PR)的蛋白质增加(综述于Kessmann，H.，Staub，T.，Hofmann，C.，Maetzke，T.，Herzog，J.，Ward，E.，Uknes，S.，and J Ryals.1994.Induction of systemic acquiredresistance in plants by chemicais.Annual Review ofPhytopa thology 32439-459；Hunt，M.D.，and J.A.Ryals.1996Systemic acquired signal transduction.Critical Review in PlantScience 15583-606；Ryals，J.，Neuenschwander，U.，Willits，M.，Molina，A.，Steiner，H.Y.，and M.Hunt.1996.Systemic acquiredresistance.Plant Cell 81809-1819；Schneider，M.，Schweizer，P.，Meuwly，P.，and J.P.Metraux.1996.Systemic acquired resistance inplants.International Journal of Cytology 168303-340；Yang，Y.O.，Shah，J.，and D.F.Klessig.1997.Signal perception andtransduction in defence responses.Genes and Development111621-1639)。已经提出SA通过增加细胞内过氧化氢浓度而发挥作用(Chen，Z.，Silva，H.，and D.F.Klessig.1993.Active oxygenspecies in the induction of plant systemic acquired resistanceby salicylic acid.Science 2621883-1885)，触发脂类过氧化作用(综述于Goodman，R.N.and A.J.Novacky.1994.The hypersensitivereaction in plants to pathogens.St.PaulAPS Press)，诱导其它氧化酶和生热反应(Raskin，I.，and B.J.D.Meeuse.1987.SalicylicacidA natural inducer of heat production in Arum lilies.Science2371601；Rhoads，D.M.and L.Maclntosh.1992.Salicylic acidregulation of respiration in higher plantsalternative oxidaseexpression.Plant Cell 41121-1139)，和提高激卫素处理的随后反应(综述于Mauch-Mani，B.and J.P.Metraux.1998.Salicylic acid andsystemic acquired resistance to pathogen attack.Annals Botany82535-540)。通过这些机制，更直接的是，SA诱导了大量防御相关性基因和蛋白质的表达(Hunt，M.D.and J.A.Ryals.1996.Systemicacquired resistance signal transduction.Critical Review inPlant Science 15583-606；Schneider，M.，Schweizer，P.，Meuwly，P.，and J.P.Metraux.1996.Systemic acquired resistance in plants，International Journal of Cytology 168303-340；Sticher，L.，Mauch-Mani，B.，and J.P.Metraux.1997.Systemic acquiredresistance.Annual Review of’Plant Pathology 35235-270；VanLoon.L.C.1997.Induced resistance in plants and the role ofpathogenesis-related proteins.European Journal of PlantPathology 103753-765Yang，Y.O.，Shah，J.，and D.F.Klessig.1997.Signal perception and transduction in defence responses.Genes and Development 111621-1639)。虽然有很多报导认为SA是这些信号转导通路的最初成分，但还不清楚它是否是原始的系统性信号，或者是否是第二次被激活信号(Mauch-Mani，B.，and I.P.Metraux1998.Salicylic acid and systemic acquired resistance to pathogenattack.Annals Botany 82535-540)。
第二个信号转导通路叫做诱导性系统抗性(ISR)，与SAR通路独立起作用。一个例示性的实施例是这样的一个研究，该研究表明促进植物生长的根瘤细菌(PGPR)在没有SA积聚物积聚或PR基因表达的情况下诱导了一种系统性类抗性现象(Pieterse，C.M.J.，VanWees，S.C.M.，Hoffland，E.，Van Pelt，J.A.，and L.C.VanLoon.1996.Systemic resistance in Arabidopsis induced bybiocontrol bacteria is independent of salicylic acid accumulationand pathogenesis-related gene expression.Plant Cell81225-1237)。进一步的研究也表明SA和PR蛋白质水平在诱导了ISR反应的时候没有增加。在诱导ISR反应的时候，发现了硫堇和小的富含半胱氨酸的植物防御素(PDF)的积聚，而且认为它们是反应的效应物(Epple，P.，Apel，K.，and H.Bohlmann.1995.An Arabidopsisthaliana thionin gene is inducible via a signal transductionpathway different from that for pathogenesis-related protein.Plant Physiology 109813-820；Penninckx，I.A.M.A.，Eggermont，K.，Terras，F.R.G.，Thomma，B.P.H.J.，DeSamblanx，G.W.，Buchala，A Metraux，J.P.，Manners，J.M.，and W.F.Broekaert.1996.Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene inArabidopsis follows salicylic acid-independent pathway.PlantCell 82309-2323)。这些研究也表明甲基茉莉酮酸酯可以是ISR的介体。该研究显示将甲基茉莉酮酸酯添加到拟南芥属植物中会导致硫堇2.1基因的诱导效应，但SA没有这样的效果(Epple，P.，Apel，K.，and H.Bohlmann.1995.An Arabidopsis thaliana thionin gene isinducible via a signal transduction pathway different from thatfor pathogenesis-related protein.Plant Physiology，109813-820)。同样地，也发现甲基茉莉酮酸酯、乙烯、百草枯除草剂和孟加拉玫瑰诱导了抗真菌植物防御素PDF 1.2在拟南芥属植物叶子上的积聚，而且这些化合物在PR-1 mRNA水平都没有任何效果(Penninckx，I.A.M.A.，Eggermont，K.，Terras，F.R.G.，Thomma，B.P.H.J.，DeSamblanx，G.W.，Buchala，A.，Metraux，J.P.，Manners，J.M.，and W.F.Brockaert.1996.Pathogen-induced systemicactivation of a plant defensin gene in Arabidopsis followssalicylic acid-independent pathway.Plant Cell 82309-2323)。相反，SA诱导了PR-1 mRNA的积聚而不是防御素或其mRNA的积聚(Penninckx，I.A.M.A.，Eggermont，K.，Terras，F.R.G.，Thomma，B.P.H.J.，DeSamblanx.G.W.，Buchala，A.，Metraux，J.P.，Manners，J.M.，and W.F.Broekaert.1996.Pathogen-induced systemicactivation of a plant defensin gene in Arabidopsis followssalicylic acid-independent pathway.Plant cell 82309-2323)。在拟南芥属植物中，nahG基因的过量表达(其特征在于非常低的SA水平)(Delancy，T.P.，Uknes，S.，Vernooij，B.，Friedrich.L.，Weymann，K.，Negrotto，D.，Gaffney，T.，Gutrella，M.，Kessmann，H.，Ward.E.，and J.Ryals.1994.A central role of salicylic acidin plant disease resistance.Science 266；1247-1250)；和在nprl突变体中(不能检测到PR-1蛋白表达)(Cao，H.，Bowling.S.Gordon，A.，and X.Dong.1994.Characterization of Arabidopsis mutant thatis non-responsive to inducers of systemic acquired resistance.Plant Cell 61583-1592)，用无毒真菌类诱导会导致防御素的积聚，这说明在SAR通路上存在缺陷的植物体维持了功能性ISR通路。而且两种拟南芥属植物的突变体都表明，对ISR诱导物不能响应会导致与ISR相关的蛋白质，而不是与SAR相关的蛋白质的表达降低。coiI和ein2都可以产生PR-l，而且在真菌诱导处理之后两者都表现出对积聚PDF1.2植物防御素的能力大大降低，尽管coiI对甲基茉莉酮酸酯没有反应(Feys，B.J.F.，Benedetti，C.E.，Penfold，C.N.，andJ.G.Turner.1994.Arabidopsis mutants selected for resistance tothe phytotoxin coronatine are male sterile，insensitive to methyliasmonate，and resistant to a bacterial pathogen.Plant Cell6751-759)，ein2对乙烯没有反应(Guzman，P.，and J.Ecker.1990.Exploiting the triple response of Arabidopsis to identifyethylene-related mutants.Plant Cell 2513-523)。这些研究和其它的研究表明，ISR和SAR反应是独特的、不同的。
不是所有的植物有这两种信号转导通路。例如，大豆被认为缺少SAR反应需要的成分。虽然用甲基茉莉酮酸酯或1-氨基环丙烷羧酸处理的大豆子叶组织能够引起对于处理点远端的细胞进行保护的效应(Park，D.-S.1998.Proximal cell competency and distal cellpotentiation in soybean resitance.Ph.D.Thesis.The Ohio StateUniversity)，但是SA不能诱导大豆防御通路中的任何可检测到的变化。
除了这种ISR通路，也已经暗示大豆可能含有另一种反应，这种反应可以“替代”在许多植物体中观察到的SA反应。这种替代反应的特征在于异黄酮的高度积聚，包括黄豆苷原和异黄酮-染料木黄酮的共轭物(在大豆幼苗组织中的质外体中以丙二酰葡糖基共轭物(MGC)的形式存在，可能由高度异黄酮特异性的非胞质β-葡糖苷酶释放(Hsieh，M.-C.1997.Purification and characterization of anisoflavone specific β-glucosidase from soybean.Ph.D.Thesis.The Ohio State University))。于是认为染料木黄酮在激活大豆细胞的防御潜能中以一定程度上类似于SA的方式起作用(T.L.Graham andM.Y.Graham 2000.Defense Potentiation and ElicitationCompetencyRedox Conditioning Effects of Salicylic Acid andGenistein.181-219.Plant-Microbe Interactions，G.Stacey and N.Keen，eds)。
异黄酮是在植物体内自然产生的植物雌激素，这些植物包括那些属于豆科的植物，尤其是包括大豆在内的属于蝶形花亚科的植物。最新研究表明可以对不属于豆科的植物进行遗传工程，以产生异黄酮。例如，已经用允许产生染料木黄酮的单一酶对拟南芥菜进行转化(Yu，Oliver；Jung，Woosuk；Shi，June；Croes，Robert A.；Fader，GaryM.；McGonigle，Brian；Odell，Joan T.2000.Production of theisoflavones genistein and daidzein in non-legume dicot andmonocot tissues.Plant Physiology 124781-793)。
异黄酮在植物体内以附着在糖分子如葡萄糖上的非活性形式存在。被称为“糖苷配基”著称的自由异黄酮形式是病原体是在遭受病原体损伤或感染时释放的。一旦被释放，糖苷配基就在细胞发动有效防御反应能力的建立中扮演多种角色。例如，异黄酮黄豆苷原是植物抗生素“植物抗霉素”大豆抗霉素的前体，而且异黄酮染料木黄酮在引发大豆对具有触发大豆抗霉素产生作用的来源于病原体的“诱导物”的识别能力(感受态)上有帮助。而且，染料木黄酮本身具有一些抗生素活性。因此，这两种糖苷配基的简单释放增强了植物防御的三个关键性的、互补的方面。甲基茉莉酮酸酯的使用大大地加强了这种反应(Graham，T.L.，and M.Y.Graham.1996.Signaling in soybeanphenylpropanoid responsedissection of primary，secondary andconditioning effects of light，wounding and elicitor treatments.Plant Physiology1101123-1133)。从而，异黄酮共扼物的积聚“负载”了大豆针对病原体的反应能力。由释放的黄豆苷原形成的大豆抗霉素“流入”异黄酮库中。
不幸的是，大豆中的异黄酮水平不总是足以有效地发动这些抗性反应。一些组织(如成熟的叶子)具有相对低的异黄酮水平，并且组织中的异黄酮含量在某些环境条件如低光照(阴天)下会降低。作为缺乏足够异黄酮水平的后果，植物体对植物病原体的进攻的抗性有所降低。
“引发”植物抵抗植物病原体进攻的方法，通过触发ISR和诱导植物体异黄酮水平的增加，都增加了植物栽培者，从农民到家庭园丁，对抗击植物病原体的可使用的选择方案。本发明提供了一种用于触发ISR和增加植物体异黄酮水平的在环境上安全的、有效且方便的制剂和方法。发明概述
本发明涉及一种在植物体内触发诱导性系统抗性的方法，其包括将有效数量的含有二苯醚的有生物学活性的制剂应用于植物体的至少一部分表面，在植物体内触发诱导性系统抗性的活化作用，从而诱导出针对至少一种病原体或疾病的系统性抗性。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种增加植物产量的方法，其包括将有效数量的含有二苯醚的有生物学活性的制剂应用于植物体的至少一部分表面，在植物体内触发诱导性系统抗性的活化作用，并维持或增加植物的总健康状况，从而增加农作物产量。
仍然在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了一种在植物体内提高异黄酮水平的方法，其包括将有效数量的含有二苯醚的有生物学活性的制剂应用于植物体的至少一部分表面，并触发异黄酮的释放或产生，从而提高植物体内异黄酮的水平。本方法也方便地提高了已被处理的植物体的大豆抗霉素诱导感受态。
本发明所述活性二苯醚优选具有如下的结构
其中R1是氢原子、氟原子或氯原子，或三氟甲基基团；R2、R3和R5独立的是氢原子、氟原子或氯原子；R4是氢原子、NR6、NR6R6、OR6、COOR6、COOCHR6CO2R6、CONHSO2R6或环醚，其中R6是氢原子，具有1～4个碳原子的支链烷基基团或具有1～4个碳原子的直链烷基基团。
本发明所述活性二苯醚也优选地具有如下结构
其中R7是氧或氮原子；R8是氢原子、CH3、含有2～5个碳原子的脂肪链或HSO2CH3。
在每一个上述实施方案中，二苯醚更优选地是氟锁草醚、苯草醚、治草醚、氯硝醚、草枯醚、消草醚、乙羧氟草醚、氟草醚、氟黄胺草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、乳氟禾草灵、除草醚、硝氟草醚或乙氧氟草醚。最优选地，二苯醚是乳氟禾草灵。
在其它优选的实施方案中，具有生物学活性的制剂进一步包括一种或多种佐剂，该佐剂选自作物油浓缩物、表面活性剂、肥料、乳化剂、分散剂、起泡剂、消泡剂和掺合剂。在更优选的实施方案中，具有生物学活性的制剂中的一种或多种佐剂是作物油浓缩物、表面活性剂和肥料。附图简述
图1描述了一种通过释放异黄酮共轭物在大豆体中建立诱导感受态的工作模型。可以在如下参考文献中找到该模型的详细描述T.L.Grahamand M.Y.Graham.1999.Role of hypersensitive cell deathinconditioning elicitation competency and defensepotentiation.Physiol.Mol.Plant Pathol.5513-20。发明详述
已经出乎意料地发现，本发明所述具有生物学活性的制剂在植物体内触发ISR并提高异黄酮水平。在本发明的一个实施方案中，用具有生物学活性的制剂处理植物体导致病原体或疾病引起的植物体破坏的发生率降低，这表现出ISR的有益效应。在本发明的另一个实施方案中，用具有生物学活性的制剂处理过的植物体更加强壮，并且在收获时获得了更高的产量，这意味着ISR是基于更广的范围且是非特异性的，从而允许植物在整个生长季节都不受障碍的生长。在本发明的第三个实施方案中，与没有处理过的植物体相比，用具有生物学活性的制剂处理过的植物体具有更高的异黄酮水平。在所有测试的植物体部位中都发现了异黄酮的提高，包括种子、子叶、叶子和茎干。
在每一个这些实施方案中，所述具有生物学活性的化合物是二苯醚，其优选地包括在以分子式(I)和/或分子式(II)表示的化合物中。
在本发明中，术语“诱导性系统抗性”或“ISR”是指一种可诱导的、整个植物体的抗性，该抗性是针对致病生物和疾病的发展和致病效应的。这种抗性可以是全面的或略低于全面的。而且，这种抗性可能是以治疗或预防的方式被诱导的。ISR也可以与术语“免疫性”、“抗性”、“抗病性”和“诱导的抗病性”交换使用。
在此所用，术语“植物体”包括单子叶植物体或双子叶植物体的所有形态和器官，其中包括但不限于种子、幼苗和成熟植物体。
1.含有二苯醚的具有生物学活性的制剂的制备
在本发明中，具有生物活性的制剂包括至少一种作为活性成分的二苯醚化合物(即具有一种在一个或两个苯环上带有期望取代基的核心结构的化合物)。
正如本领域普通技术人员可以理解的，此处所使用的术语“二苯醚”包括该化合物的任何活性形态，包括酸性和盐性形态、代谢物、立体或光学异构体的外消旋混合物、纯化的异构体等。
为了触发植物体内诱导性系统抗性和/或增加植物产量，二苯醚优选地具有如上边(I)所示的结构。适合用于本发明二苯醚的非限定性实施例包括氟锁草醚、苯草醚、治草醚、氯硝醚、草枯醚、消草醚、乙羧氟草醚、氟草醚、氟黄胺草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、乳氟禾草灵、除草醚、硝氟草醚或乙氧氟草醚。
在另一个实施方案中，该方法包括对植物施用一种农用化学组合物，该化学组合物包括植物学上可接受的载体或稀释剂以及有效数量的二苯醚，其优选地具有如上边(II)所示的结构。下边给出了在本方法中有用的、已经被检验过的几种优选的二苯醚结构。
乳氟禾草灵
氟锁草醚
氟黄胺草醚
仍然在另一个实施方案中，二苯醚具有如分子式(III)表示的结构
其中R9是H、Cl、I、Br、CF3；R10是含有1～5个碳原子的支链脂肪链。分子式(II)和(III)所示的化合物在提高植物体内异黄酮水平的方法中尤其有用。
本发明所述具有生物学活性的制剂是通过将活性成分混合到水中获得的。可以将一种二苯醚化合物或其混合物用作活性成分。尽管本领域的普通技术人员将理解到，可以准备不同数量的具有生物学活性的制剂，这依赖于被处理区域的大小，但有效的量是15加仑。同样地，可以在优选的实施方案中将0.0050～0.50磅的活性成分混合到15加仑的水中来获得本发明所述具有生物学活性的制剂，更优选的是O.050～0.125磅，最优选的是大约0.1磅。当然，这些界线不是绝对的，并且本领域的普通技术人员可以容易地确定出这些外围界线。
在本发明中用作活性成分的优选的二苯醚是乳氟禾草灵(C19H15ClF3NO7)(2-乙氧基-1-乙基-1-氧代乙基5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯甲酸盐)。用作活性成分的含有乳氟禾草灵的具有生物学活性的制剂一般是通过将乳氟禾草灵混合到水中得到的。优选地是将0.005～0.50磅的乳氟禾草灵混合到15加仑的水中，更优选地是0.050～0.125磅，最优选地是大约0.1磅。
可以买到的乳氟禾草灵的代表性类型是由Valent U.S.A.Corporation生产的除草剂Cobra。Cobra已经被批准用作一种选择性的广谱除草剂，其用于对敏感的阔叶杂草在出苗前和出苗后进行控制(美国环保署登记编号59639-34)。以重量百分比计算，可以买到的Cobra包括23.2％的乳氟禾草灵和76.8％的其它成分，以每加仑含2磅乳氟禾草灵的液体出售。包括Cobra的，含有作为活性成分的乳氟禾草灵的具有生物活性的制剂是通过将Cobra混合到水中获得的。正如下边的实施例中使用时和通常是在田地中使用时，优选地将0.25～50液量盎司的Cobra混合到15加仑的水中，更优选地是2.5～10液量盎司，最优选地是大约6液量盎司。
乳氟禾草灵的其它有用的类型包括除草剂乳氟酰亚混剂，同样也是Valent U.S.A.Corporation生产的(美国环保署登记号59639-92)。以重量百分比计算，乳氟酰亚混剂包括26.6％的乳氟禾草灵、7.6％的酰亚胺苯氧乙酸戊酯和65.8％的其它成分。酰亚胺苯氧乙酸戊酯是酰亚胺苯氧乙酸戊酯除草剂中的活性成分。
尽管本发明所述具有生物活性的制剂可以只包括二苯醚，优选地该制剂也可以包括一种或多种佐剂。有用的佐剂包括，并不限于此，作物油浓缩物、表面活性剂、肥料、乳化剂、分散剂、起泡剂、消泡剂和掺合剂。佐剂通常会促进二苯醚活性成分通过植物细胞壁。植物学上可以接受的载体是一种生理学上可以接受的稀释剂或佐剂。术语“生理学上可以接受的”是指不干扰二苯醚效力的无毒材料。特定佐剂或载体的有效性依赖于处于其它因素中的用本发明所述制剂处理的植物种类，植物的成长阶段和相关的环境条件，施用途径以及特定化合物或化合物在组合物中的组合。在更优选的实施方案中，具有生物活性的制剂中的一种或多种佐剂是作物油浓缩物、表面活性剂和肥料。这些制剂的制备是在本领域技术水平之内。
包括二苯醚、作物油浓缩物、表面活性剂和肥料的具有生物学活性的制剂是按照如下顺序将每种化合物混合到水中制备的肥料、二苯醚、作物油浓缩物、表面活性剂。尽管本领域的普通技术人员将理解到，可以准备不同数量的具有生物活性的制剂，这依赖于被处理区域的大小，但有效的量是15加仑。同样地，本实施方案中的具有生物学活性的制剂可以通过将0.1～10磅的硫酸铵混合到15加仑的水中来制备，更优选地是1～4磅，最优选地是大约2磅。在本发明该实施方案的制剂中有用的代表性肥料包括硫酸铵。在本发明该实施方案的制剂中有用的第二种代表性肥料是尿素硝酸铵。在使用了尿素硝酸铵的实施方案中，优选地将约1～200液量盎司的尿素硝酸铵混合到15加仑的水中，更优选地是25～100液量昂司，最优选地是大约50液量昂司。接着，优选地将0.005～0.5液量昂司的二苯醚活性成分混合到制剂中，更优选地是0.050～0.125磅，最优选地是大约0.1磅。正如上边提到的，可以将一种二苯醚化合物或其混合物用作活性成分。然后，接着优选地将大约1～100液量昂司的作物油浓缩物混合到制剂中，更优选地是大约5～25液量昂司，最优选地是大约10液量昂司。通常，以重量百分比计算，作物油浓缩物包括65-96％的烃油或溶剂，其余为表面活性剂。烃油可以是石油或基于植物的。在本发明所述制剂中有用的代表性作物油浓缩物包括甲基化种子油，氨基磺酸铵(HelenaChemical Co.)和草乳混(Loveland Industries Inc.)。最后，将优选数量的非离子型表面活性剂混合到制剂中，通常在大约0.1～25液量昂司范围内，更优选地是大约2～10液量昂司，最优选地是大约5液量昂司。表面活性剂可以从许多商业来源获得。有用的形态包括阴离子型、阳离子型、非离子型和两性表面活性剂。在本发明所述制剂中有用的代表性表面活性剂包括Kinetic(Helena Chemical Co.)和因杜斯(Helena Chemical Co.)。
在本发明进一步的实施方案中，具有生物学活性的制剂也可以包括一种或多种其它的活性化合物，如除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂和植物生长调节剂。正如本发明所使用，术语“其它的活性化合物”是指那些具有除了在植物体内触发ISR能力以外的活性的化合物，如杀虫剂、除草剂、杀真菌剂、杀细菌剂等。在优选的实施方案中，在具有生物学活性的制剂中的一种或多种其它活性化合物是除草剂。可接受的除草剂的非限定性实施例包括2，4-滴丁酸、喹禾灵/精喹禾灵、噻草平、氯嘧黄隆、唑嘧磺胺酯、精吡氟禾草灵、高噁唑禾草灵、咪氟混剂、咪异混剂、咪草烟、胺硝草、氯嘧噻黄隆、草甘瞵、抑草生(Select 2 EC)、灭草喹和噻黄隆。含有除草剂的具有生物学活性的制剂是通过将除草剂混合到水中制备的，随后是肥料(如果需要)、二苯醚活性成分、作物油浓缩物(如果需要)和表面活性剂(如果需要)，并且以列出的顺序加入。对于15加仑的具有生物学活性的制剂，可以通过将大约0.005～10磅的除草剂活性成分混合到15加仑的水中来制备混合物，优选地是大约0.5～5磅，最优选地是大约1磅。然后将剩余成分混合到如上边指出的制剂中。在本发明所述制剂中有用的代表性除草剂是草甘瞵(Monsanto Corp.)，为一种在出苗后使用的非选择性的系统性除草剂。
本领域普通的技术人员将理解到，本发明所述具有生物学活性的制剂的所有实施方案也可能包括其它惰性成分，以便提供一种更令人满意的制剂，只要是不减损本发明基本成分效果的惰性成分。组合物可以进一步包括或者提高二苯醚的活性或者补充其活性的其它试剂。可以将这样的附加因素和/或试剂包括在该组合物中，以便与二苯醚产生协同作用，或最大地降低副作用。该组合物可以进一步包括填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂和其它本领域非常熟知的材料。
2.具有生物学活性的制剂在植物体上的应用
本领域的普通技术人员将理解到，尽管优选地该制剂含有至少一种佐剂，但可以通过使用只包含二苯醚的制剂来实施本发明的这些方法。本发明所述方法可以通过使用包含二苯醚、一种或多种佐剂的制剂，包括或不包括其它活性化合物，包括或不包括其它惰性成分的组合物来实施。进一步可以理解到，可以同时或按顺序(按照任何期望的顺序)使用二苯醚、一种或多种佐剂、其它的活性化合物以及其它的惰性成分，只要每一种成分按照与本发明所述目的发挥作用。如果按照顺序使用，每种成分可以在短时限或长时限内使用。
可以将本发明所述具有生物学活性的制剂用于种子、根部或叶子和茎干。可以通过用可能含有“粘附剂”的粉状组合物来涂敷种子的方式将该组合物施用于种子，或者以液体或颗粒形式用于土壤、或者用于种子和/或根部区域。在一次使用中，可以将该组合物应用于植物体的表面，直到植物的叶子部分变湿、完全变湿或从叶子上滴下。对植物体的处理也可能包括将该组合物加到植物体的供水系统，或如果植物体是在组织培养基中生长的话，就加到容器中。可以在白天或晚上的任何时间使用该制剂，均产生良好的抗病性，但优选地用于生长正活跃的植物并且至少在预知下雨之前30分钟使用。如果先前的诱导性抗性开始减弱，证据是观察到了疾病症状，那么只要认为有用就可以不断地重复使用该制剂，以一次或多次“加强”使用来应用于增强抗性。因此，该制剂被认为可能既是“预防性”又是“治疗性”的。在优选的实施方案中，通过将制剂喷洒到植物体上来使用该制剂。将制剂喷洒到植物体上的方法的非限定性实施例包括一个拖拉机悬臂式喷雾机、手动式烟雾剂喷雾机、鼓风喷雾机和直升机或机翼固定的飞机悬臂式喷雾机。优选地，将喷雾机校准到每英亩喷洒约1～100加仑制剂，更优选地是每英亩大约3～50加仑，最优选地是每英亩大约15加仑。
对本领域普通的技术人员来说显而易见，在植物体内触发ISR需要的“有效数量”的二苯醚化合物可以在很大的范围内变化，这依赖于许多因素，包括植物的种类及其生长阶段，行距及植物间距，环境条件，气候等等。然而一般而言，已经确定出具有生物学活性的制剂包括二苯醚，而且二苯醚的使用量通常是每英亩约0.001～10磅的活性成分，这个量足以在使用了该制剂的植物体内触发ISR。更优选地，每英亩大约使用0.01～1磅的活性成分来触发ISR。最优选地，每英亩大约使用0.05～0.25磅的活性成分来触发ISR。
用于诱导增加异黄酮水平的二苯醚的有效数量要足以在处理的植物体内增加异黄酮的水平，如染料木黄酮和黄豆苷原，使其高于对比的未处理的植物体内的异黄酮水平。可以通过例行检验来决定这个数量，例如用下边提到高效液相色谱来测量。将该组合物施用一次就可以获得这个有效数量。另外，还可以将该组合物多次施用于植物体来获得这个有效数量。该组合物中二苯醚的数量依赖于使用的特定化合物或化合物的混合物、被处理的植物组织以及植物吸收该组合物的能力。例如，植物体的嫩叶子比老叶子要更容易地吸收大部分组合物。可以预测到用于实施本发明所述方法的不同组合物每剂应当包括约200微摩尔～2毫摩尔的二苯醚。
在优选的实施方案中，应用于植物体的具有生物学活性的制剂包括肥料、二苯醚、作物油浓缩物和表面活性剂。优选地，加到该制剂中的肥料的量要便于以每英亩约0.1～10磅的比率来使用肥料，更优选地大约是每英亩1～4磅，最优选地大约是每英亩2磅。优选地，该优选制剂使用的二苯醚在上边讨论的范围内。优选地，该制剂的作物油浓缩物以每英亩大约1～100液量盎司的比率使用，更优选地是每英亩大约5～25液量盎司，最优选地是大约每英亩10液量盎司。优选地，该制剂的表面活性剂以每英亩大约0.1～25液量盎司的比率使用，更优选地是每英亩大约2～10液量盎司，最优选地是大约每英亩5液量盎司。此外，也应该预测到在这些总的指导方针下，本领域普通的技术人员能很容易地选择合适的制剂和每英尺的使用量，以实现本发明的目标及优势。
用本发明所述具有生物学活性的制剂触发的ISR和/或增加的异黄酮水平会产生针对病原体和疾病的植物体抗性，并且依赖于使用方法和使用条件，本方法将提供特定的和/或广谱的疾病控制，包括阻止真菌感染以及细菌、病毒和线虫类病原体的感染。植物病原体的非限定性实施例包括昆虫(如双翅目、膜翅目、甲虫类、鳞翅类、直翅目、半翅类和同翅类)、细菌(例如大豆中的丁香假单胞菌大豆致病变种和野油菜黄单胞菌菜豆病原变种)、病毒(例如大豆中的菜豆豆荚斑驳病毒、豇豆褪绿斑驳病毒、花生斑驳病毒、大豆矮缩病毒、大豆花叶病毒、烟草环斑病毒、烟草条纹病毒、菜豆黄色花叶病毒、黑豆斑驳病毒、豇豆和性斑驳病毒、豇豆烈性花叶病毒、印度尼西亚大豆矮缩病毒、绿豆黄花叶病毒、花生条纹病毒、大豆褪绿斑驳病毒、大豆皱叶病毒、大豆黄脉病毒和烟草花叶病毒)、霉菌(例如大豆中的大豆蛙眼叶斑、大豆棕霉(Chaetomium cupreum)、木豆炭疽、大豆荚茎腐烂复合病、大豆镰刀菌根腐、大豆炭腐、大豆霜霉)和线虫类(例如大豆中的大豆胞囊线虫、纽带线虫、根斑线虫、肾形肾脏线虫、根结线虫和刺线虫)。
植物体疾病的非限定性实施例包括1)传染病，如a)细菌疾病(例如大豆中的细菌疫病、细菌斑疹病、细菌褐色斑点、大豆野火病、细菌萎蔫病和冠瘿病)；b)类菌支原体疾病(例如大豆中的Machismo病、芽增生病、丛枝病和变叶病)；c)叶子、茎干上部、豆荚和种子的真菌疾病(例如大豆中的链格孢叶斑死荚病、炭疽病、褐斑病、大豆紫染色疫叶斑病、小扁豆叶腐烂病原体所致叶枯病、霜霉、蛙眼叶枯病、叶点霉叶枯病、白粉病、红叶斑枯病、丝核菌致地上部分立枯病、锈病、赤霉病和黑斑病)；d)根部和茎干下部的真菌疾病(例如大豆中的褐茎腐病、炭腐病、链孢菌枯病或萎蔫病、根腐病以及荚根颈腐病、茎腐病、荚茎枯病、大豆荚茎腐烂所致种子腐烂病、茎溃疡、大豆猝倒、红冠腐烂病、丝核菌病、菌核腐病、大豆南方疫病以及大豆串珠霉根腐病)；e)病毒疾病(例如大豆中的芽枯病、大豆花叶病)；f)线虫疾病；g)种子的种传细菌和细菌性疾病(例如大豆中的杆菌种子腐烂病)，h)种子的种传真菌和真菌性疾病(例如大豆中的大豆黑斑所致荚种腐烂病、大豆紫斑病、大豆酵母斑(Nematospora Spot)和大豆荚茎腐烂所致种子腐烂病、)，I)种传病毒；2)未知原因或原因不能确定的疾病(例如大豆中的叶枯病、突死综合症和黄叶斑点病)；和3)非感染性或逆境性疾病(如结壳和收缩、霜冻、冰雹、热溃疡、电害、日烧、缺水、矿质营养缺乏和毒性、除草剂损害、杀虫剂损害和空气污染物)。施用的特定实施例将用于大豆疫霉根腐病、大豆菌核白霉病、褐茎腐病和大豆包囊线虫的控制。
也出乎意料地被发现，用本发明所述具有生物学活性的制剂触发的ISR和/或异黄酮水平的增加可以导致增加植物的产量。在本发明中，术语“产量”指植物产生的可用的植物产品。在本发明中，植物产量以每英亩的干重量表示，以蒲式耳为单位。与在相同环境条件下生长的但没有使用本发明所述活性制剂的同样的植物相比，当恰当地使用本发明所述具有生物学活性的制剂时，该制剂至少可以使植物产量大约增加0.5％，更优选地至少增加5％，最优选地增加30％或更多。在有很多英亩土地的大农场，即使产量增加0.5％，经济上的增加也会很显著。可以使用与上边所列出的用于制备具有生物学活性制剂的通用指导原则以及在植物体上使用的有效比率来达到本发明的目的。
可以产生异黄酮的植物包括那些能自然产生异黄酮的植物，如豆科植物、蝶形花亚科植物，以及已经使用了遗传工程后能够产生异黄酮的植物。
在进一步的实施方案中，本发明提供了含有ISR的植物，尤其是农作物。尤其有用的一个方面是，ISR是长期持续的，通常会坚持到收割时间。如果期望的话，可以在最初使用了该制剂后的晚些时间使用免疫加强。如果最初的抗性开始减弱，也就是如果植物体出现疾病症状时就可以使用免疫加强。
本发明所述方法可以用于在很多种植物体内触发ISR和/或增加异黄酮水平，包括蔬菜和水果作物、豆类、谷类、果树、浆果、森林树种、观赏植物以及其它植物如咖啡和棉花。在本发明的一个优选实施方案中，该方法被用来在豆类植物体内触发ISR和/或异黄酮水平的增加，如大豆、利马豆、斑豆、青豆、豌豆、鹰嘴豆和绿豆。
本发明的范围也适用于ISR和/或异黄酮水平增加很重要的农作物。通过使用含有二苯醚的具有生物学活性的制剂，这些植物表现出抵抗一大批病原体和疾病进攻的系统性能力。与当前的植物保护方法相比，该方法有很多的优势。这些优势包括，但不限于1)广谱控制，因为ISR比大多数杀真菌剂和杀细菌剂的专一性低；和2)使用频率低，因为ISR比大多数杀真菌剂和杀细菌剂提供的保护更系统而且更持久。
已经观察到，本发明所述的ISR和/或异黄酮水平增加的触发产生了至少可以持续好几周(例如，4到6周)的系统性抗性，而且可以在整个生长季节和/或植物的整个生命周期中持续。另外，用本发明所述方法处理可能产生在某种程度上低于总疾病抗性的抗性。这种已降低的抗性仍然可以给植物体提供针对病原体和疾病的抗性。已降低的抗性可能不是完整的抗性，但可以充分地降低病原性生物体的生长，并降低这些生物体的病原效应。
本发明意想不到的一个优势是，用本发明所述方法诱导的抗性是非专一性的。已经发现用本发明所述方法处理的植物体对于病原体生长及来自宽范围的病原体疾病具有抗性，这些病原体包括细菌、霉菌和病毒。这种非特异性抗性与抗性栽培种的特异性抗性和控制疾病的其它化学方法大不相同。由于这种非特异性，ISR能够保护植物体免遭仍然不知道可用其它方法处理的病原体的侵犯。
3.评价二苯醚在大豆系统中对于异黄酮产生和防御诱导物激活上的发生效应的方法
大豆子叶分析是评估大豆系统内防御诱导物活性的标准分析。该分析方法存在两种修改后的方式，它们可以用来决定细胞核受体的配体的有效浓度。
切割开的子叶分析
这种切割开的子叶分析被用来研究一种化合物(效应物)在植物体内激活基础诱导感受态的能力，以及评估二级化合物(诱导物)在植物体内提高大豆抗毒素诱导感受态的能力，在该过程中，异黄酮库是用效应物的作用“满载”的。
在加入不同二苯醚之后，来测量子叶组织中的异黄酮水平，以确定每种二苯醚在诱导子叶组织中(效应物研究)异黄酮基础产量的效果。在诱导物研究中，加入的二苯醚首先“激发”切割的子叶。也就是，响应来自大豆疫腐病原体的葡聚糖诱导物的植物抗毒素大豆抗毒素的诱导感受态已经被先前加入的二苯醚部分激活。结果，在存在葡聚糖的情况下，大豆抗毒素的前体，即二苯醚诱导的、增加后的黄豆苷原水平被迅速转换到大豆抗毒素。因此，也可以测量一种化合物通过“满载”异黄酮库而提高大豆抗毒素诱导感受态的能力。
从年龄7～8天的大豆幼苗的植物体上摘取子叶，在较低的表面切割开，暴露出表皮下的组织。在目的仅为研究效应物作用的实验中，用15ul剂量的二苯醚或水(对照)处理子叶。在诱导物研究中，进一步用15ul剂量的来自真菌病原体，即大豆疫腐病原体或水(对照)的葡聚糖防御诱导物(30ug/ul)处理子叶。每次处理使用10个子叶，并且放在含有湿滤纸的培养皿中，以便保持子叶湿润。在大约200微爱因斯坦单位(uA)的光照及室温条件下培育48小时后，收获子叶组织，用来分析。用1号穿孔器从子叶上垂直切割细胞柱，来获得用于分析的组织。然后细胞柱被用细胞切片的方式再次分割成次样品，是从原始切割表面进行连续地切片。第一个切片大约是4层细胞厚，接下来的两个切片大约是8层细胞厚。这样可以使分别观察处理的近端和远端效果成为可能。用下边提到的HPLC对组织进行分析。可以在出版物Graham，T.L.，and Graham，M.Y.1991.Glyceollin ElicitorsInduce Major But Distinctly Different Shifts in IsoflavonoidMetabolism in Local and Distal Cell Populations.Mol.PlantMicrobe Inter.460-68中找到该分析的完整细节。
折断的子叶分析
折断的子叶分析是一种最小创伤分析，用于在无激发背景下研究试验化合物的效果。将子叶折成两半，并将叶柄侧朝下放入0.5％的水琼脂中来进行该分析。每次处理使用10个折断的子叶，并且用正在检查的葡聚糖防御诱导物和/或效应物(即二苯醚)处理因折断而暴露的表皮下细胞。如同在切割开的子叶分析中一样，在光照下将子叶培育48小时。收获近端(第一个细胞层)和远端(第二和第三个细胞层)组织用于HPLC分析(参考下文)。可以在出版物Graham，T.L.，andGraham，M.Y.1996.Signaling in soybean phenylpropanoid responsesdisscction of primary，secondary and conditioning effects oflight，wounding and elicitor treatments.PlantPhysiol.1101123-1133中找到该分析的完整细节。
折断的子叶分析是“天然的”。也就是，它不是被预先安排或激发于响应葡聚糖诱导物的植物抗毒素大豆抗毒素的诱导感受态中。因此，用葡聚糖诱导物进行的处理诱导了异黄酮黄豆苷原和染料木黄酮，但大豆抗毒素很少形成。这是一种很优秀的分析，用于研究一种化合物对异黄酮新陈代谢的效应是由其本身引起还是与葡聚糖结合而发挥作用。在不存在葡聚糖的情况下，该分析可以提供化合物单独作用于异黄酮新陈代谢上的效果的优质图象。在存在葡聚糖的情况下，该分析告诉我们试验化合物是否可以诱导大豆抗毒素对葡聚糖反应的诱导感受态。
4.用二苯醚处理的子叶中的异黄酮水平的HPLC分析
高效液相色谱(HPLC)是一种精选的、用于确定大豆中异黄酮防御化合物水平的方法。在一个单一的HPLC分析中，人们可以得到一个高达50或更多个芳族化合物的完整的定量描述，包括所有的异黄酮和其共扼物以及植物抗毒素，包括大豆抗毒素。该方法只需要很少量的植物体组织，仅为20mg，并且可以容易地将该方法用于子叶、叶子或任何大豆组织。该分析方法允许我们确定每种代谢物的纳摩尔数/克数，然后可以与水或葡聚糖处理的对照组织比较，很容易地进行处理，以便比较每种给定的代谢物的百分率的增加或减少。一般来说，组织是在80％的乙醇中提取的，然后在C18反相HPLC柱中用水/丙腈梯度洗脱。可以在出版物Graham，T.L.1991.A Rapid High Resolution HighPerformance Liguid Chromatography Profiling Procedure for Plantand Microbial Aromatic Secondary Metabolites.PlantPhysiol.95584-593中找到该过程的完整细节。实施例
下面的实施例仅仅对本发明优选的方面作了说明，不能理解为以任何方式限定本发明。
实施例1-大豆作物上的乳氟禾草灵效果的野外实验
A)本实施例说明了包括乳氟禾草灵、表面活性剂和硫酸铵的制剂在大豆中触发ISR的效果，正如保护大豆不受大豆菌核腐病病原体(S.sclerotiorum)的进攻中所证明的。实施例中所用的乳氟禾草灵的类型是Cobra。所用的表面活性剂的类型是因杜斯。草甘膦也被包括在一些制剂中，以控制试验地中的杂草。制备5种不同的制剂，每种是15加仑。每种制剂中的每个成分的特征和浓度列在表1的第1栏。
按照完全随机分组设计(RCBD)安排四种处理情况，以便对结果进行差异统计分析(ANOVA)。为四种处理情况中的每一种建立四个相同(样地)。每一块样地宽25英尺，长200英尺。
当具有三个小叶的叶子中的三个已经伸开，而第四个呈现杯状处于在V3生长阶段时，在第40天对每块地使用不同的制剂。每种制剂都用拖拉机悬臂式喷雾机来施用，并将喷雾机调整到每英亩喷洒15加仑。在第40天分别在四块地中每一块使用处理情况1、2、3和4中的制剂1、2、3和4。在第47天，在处理情况4中的四块地中使用制剂5。
在第104天，从四种处理情况中的每一种中，随机地选择5个纵行中的单个大豆植物体，并用来检查大豆菌核腐病病原体(S.sclerotiorum)进攻的迹象。S.sclerotiorum进攻的迹象包括含有白色菌丝体的棕色茎干区域以及整个植物的枯萎。在发现一种处理的一个重复样地中没有疾病发生后，只在四种处理情况中每一种的其它三个相同样地中进行检查。在表1的第4栏对四种处理情况中的每一种的检查结果的均值做了总结。在第110天，再次对四种处理情况的每一种(三个相同的样地)中的单个大豆植物体进行检查，以检查S.sclerotiorum进攻的迹象。在表1的第5栏中，对每种处理情况的三个相同地块的检查结果的均值做了总结。用Student-Newman-Keuls试验进行差异分析。后边跟有相同字母的均值没有显著的不同。
在第142天，收割四种处理情况的每一种的大豆植物。每种处理情况的三个相同样地的产量均值在表1的第6栏做了总结，其中将湿度调到13％。在同一天也确定出每一样地中植物体水分含量的均值，其结果在表1的第7栏做了总结。
这些结果说明了，与处理情况1相比，用于处理情况2、3和4的制剂都显著的降低了S.sclerotiorum进攻的发生率。处理情况2、3和4均使用了含有二苯醚乳氟禾草灵的制剂，而处理情况1则没有使用。而且，在每一块样地使用了该制剂60天后，在处理情况2和3中，ISR在整个生长季节都对植物提供了保护。该结果也说明，处理情况2和3收获的大豆产量在统计数字上比处理情况1高，处理情况4收获的产量比处理情况1的显著提高。这说明系统性抗性的诱导会使植物更健康、更茁壮，从而导致更高的产量。正如在表1中看到的，从四块地收割植物时的湿度百分比没有显著地不同，这说明侵染和产量结果不受植物吸收和维持湿度的能力的影响。
表1斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的不同(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
B)表2概括了在俄亥俄州、伊利诺斯州和宾夕法尼亚州的不同农场进行的大量实验性野外实验的结果。正如表2中可以看到的，尽管很多因素随着不同的农场有所改变(如所用的乳氟禾草灵的类型、制剂组合物、对照组合物、气候条件、土壤条件、种植条件等)，与用不含乳氟禾草灵的对照制剂处理的大豆相比，含有乳氟禾草灵的制剂处理的大豆作物显著地降低了S.scerotiorum损害的发生率。而且，用乳氟禾草灵处理的样地的作物产量通常高于对照样地的产量。在使用了乳氟禾草灵和对照植物之间的水分含量没有显著的变化。
在这些现场实验中所用的乳氟禾草灵的类型或者是Cobra或者是乳氟酰亚混剂。在该实施例中所用的一种或多种制剂中所用的佐剂是作物油浓缩物、非离子型表面活性剂、硫酸铵和尿素硝酸铵。在该实施例中所用的一种或多种制剂中所用的其它活性化合物是除草剂草甘膦、Python、抑草生、唑嘧磺胺酯和咪异混剂。
表2斜体字表示的制剂是对照组
C)其它野外实验表明，用乳氟禾草灵触发的ISR可以保护大豆作物免遭大豆疫霉病原体(Phytophthora sojae)的进攻。大豆种子(Pioneer93B01 RR)是在宽25英尺、长300英尺的样地中种植的。在一个RCBD中将处理情况重复3次。在同一田地中建立了2个独立的试验。在R1生长阶段(第一天)使用乳氟禾草灵。在第64天，从每一样地中取10个样品，每一样品包括行宽为5英尺长的区域中的植物。对每一样品中的每一植物检查P.sojae的迹象。表3概括了该研究的结果。正如从这些结果可以看到的，乳氟禾草灵显著地降低了P.sojae的生长，并且增加了农作物总产量。
表3斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的不同(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
D)进一步的野外实验表明，用乳氟禾草灵触发的ISR可以保护大豆作物免遭F.solani f.sp.glycines引起的突死综合症。大豆种子(BSR101、Asgrow A 3701(RR)品种，或Pioneer P9344(RR))是在感染了F.solani f.sp.glycines的土壤中种植的。处理是在1倍使用率，而且是在营养状态下使用。正如从下边的结果可以看到的，乳氟禾草灵显著地降低了F.solani f.sp.glycines引起的破坏。
E)温室研究进一步表明，用乳氟禾草灵触发的ISR可以保护大豆作物免遭F.solani f.sp.glycines引起的突死综合症。大豆种子(BSR 101、Asgrow A 3701(RR)品种，或Pioneer P9344(RR))是在感染了F.solanif.sp.glycines的土壤中种植的。处理是在1倍使用率，而且是在营养状态下使用。
从这些植物根部定期分离病原体表明，用根部腐烂严重程度测量的根部感染有了显著的降低。在叶子部分使用乳氟禾草灵之后，大豆根部F.solani f.sp.glycines的无性繁殖的降低表明，针对F.solani f.sp.glycines的诱导性抗性是系统性的。
实施例2-乳氟禾草灵用于大豆的时间变化
该野外实验是在宾夕法尼亚州的Muncy附近的一个农场进行的，目的在于确定使用乳氟禾草灵的时间变化是否对ISR有影响，通过抑制S.sclerotiorum的生长来加以表明。在14个分离的行中种植大豆种子(Pioneer 9352)。四种处理以RCBD形式安排，即每种处理有四种相同的样地。处理情况1是未处理的对照组。在处理情况2中仅使用了作物油浓缩物。在处理情况3中，当大豆处于V4生长阶段时(第1天)，对大豆植物使用Cobra和作物油浓缩物。在处理情况4中，于R1生长阶段(第12天)对大豆植物使用Cobra和作物油浓缩物。正如从表4概括的结果可以看到的，使用乳氟禾草灵的时间变化对乳氟禾草灵的ISR诱导能力没有显著的影响。
表4斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的不同(P＝.05，Student-Newman-Keuls)实施例3-乳氟禾草灵对大豆作物产量效果的野外实验
表5概括了乳氟禾草灵处理的大豆与对照植物相比的作物产量的测量结果。大豆是从俄亥俄州的农场收割来的。正如表5中可以看到的，尽管很多因素随着不同的农场有所改变(如所用的乳氟禾草灵的类型、制剂组合物、对照组合物、气候条件、土壤条件等)，与对照组地块相比，含有乳氟禾草灵的制剂所处理的大豆作物的产量通常有所提高。在使用了乳氟禾草灵的植物和对照组的植物之间的水分含量没有显著的变化。
在这些现场实验中所用的乳氟禾草灵的类型是Cobra或乳氟酰亚混剂。在该实施例中所用的一种或多种制剂中所用的佐剂是作物油浓缩物和硫酸铵。在许多制剂中也使用了草甘膦。
表5斜体字表示的制剂是对照组实施例4-折断的子叶处理情况中所示的异黄酮水平的诱导
植物体材料从年龄7天的威廉斯品种的大豆上摘取子叶；每次处理，使用10片子叶进行分析。
制剂/组合物被测试的二苯醚包括乳氟禾草灵、氟黄胺草醚和氟锁草醚。在水中溶解二苯醚或首先在异丙醇中溶解以得到一种饱和溶液，接着在水中快速稀释。异丙醇最终的浓度不要超过0.5％。从1mM连续进行3倍稀释，在大约10uM～1mM的浓度范围内测试二苯醚。对二苯醚进行单独测试，并在存在30ug/ml的来自真菌病原体phytophthora sojae的葡聚糖的诱导物的情况下进行测试。二苯醚的浓度及此处提到的葡聚糖的浓度就是经过处理的子叶的最终浓度。
处理情况用7uL正在测试的二苯醚处理每个折断的子叶所暴露的表面，接着用7uL的葡聚糖或水处理。在恒定的光照下(200uA)将子叶培育48小时。
分析在第48小时，从处理的子叶表面获得一个薄的(半透明的)切片。在浓度为80％的乙醇中将每次处理的从10片子叶上获得的切片混合并提取(每50毫克新鲜重量用400uL乙醇溶液)。然后如上边描述的将提取物放到HPLC上。结果在表6中给出，这些结果表明二苯醚既能诱导异黄酮的基础水平，也能“激发”子叶的感受态。表中的值是两次独立实验的平均值。标准误差低于所有值的平均值的15％。
表6
并且在切割开的子叶分析(威廉斯品种的子叶)中，在高于50～500uM的浓度范围下，进行了二苯醚的测试。在这个浓度范围内，以异黄酮的增加范围来表示，甲状腺素活性是20～40％。实施例5-在其它植物体和植物器官中的异黄酮水平的诱导
A)如上边实施例4所描述的，在切割子叶分析中，用含有乳氟禾草醚的组合物处理包括利马豆、绿豆、青豆、花生和鹰嘴豆在内的豆类。将该组合物用于分析中的适当年龄植物体的子叶上，即完全展开的、绿色的和未衰老的组织上。
以100～200uM的浓度使用乳氟禾草醚。当100uM的乳氟禾草醚被用于切割子叶时，可以观察到在利马豆、鹰嘴豆、青豆和花生中的芳族代谢物的增长范围为20～500％。这些芳族代谢物没有被明确地识别。然而，它们的紫外线光谱表明大部分是异黄酮。
B)以与如上边实施例4所描述的方法相同的方法处理大豆植物的真叶。可以用两种方法测试大豆或其它植物的真叶。在实验室中，使用固定在水泵上的滤片平台，用真空装置吸入叶子上的一个小块。将叶子放置在滤片平台上，使用轻轻吸入方法。然后将一滴葡聚糖诱导物和/或化合物处理物放置在叶子的暴露表面上，并且允许通过叶子的气孔渗透进组织中。而对于在温室或田地中，则该化合物用于制剂中时，用表面活性剂将其乳化并分散。在每一分析中，用如上所描述的HPLC再次分析该组织。
如果渗透进大豆叶子组织中，使用100uM的乳氟禾草醚会使得异黄酮染料木黄酮共轭物增长6倍，使异黄酮黄豆苷原至少增长10倍，它们在在成熟大豆叶子中的水平几乎检测不到。
C)而且田地和温室研究也被用来确定将乳氟禾草醚直接用于大豆叶子是否会诱导黄豆苷原和染料木黄酮的糖苷配基水平以及染料木黄酮共扼物的增加。下边的表7以增加百分比列出了在整个适当对照处理情况中叶子组织对于乳氟禾草醚的响应。在田地中(俄亥俄州和宾夕法尼亚州)，每英亩使用6盎斯的Cobra，并且在处理后将叶子分析8天。在温室中，以50微摩尔级使用乳氟禾草醚，并且在处理后将叶子分析48小时。
正如这些结果所表明的，大豆叶子对于乳氟禾草醚的响应是通过产生黄豆苷原和染料木黄酮的糖苷配基以及染料木黄酮共扼物的非常大量的增长而实现的。
表7实施例6-大豆种子中异黄酮水平的诱导
在每一样地的两个节点位置(每个样地取出3个大豆植物体作样品)进行分析，以分别确定黄豆苷原、共扼的黄豆苷原、染料木黄酮和共轭的染料木黄酮的水平。结果以四种指定的异黄酮的总量给出。将确定出的较低节点样品的值与较高节点样品的值相加，将所得到的值除以2就得到每一块样地的异黄酮水平的均值。每种处理是由3个相同样地的总数与每块样地的2个样品相乘构成＝每次处理有6个样品。
A)Chemgro2289是在位于宾夕法尼亚州的Waterford的Port农场的田地里种植的。是在1999年6月24日，在V4/V5阶段使用制剂的。大豆是于1999年10月6日，在处理之后的104天收割的。叶子样品是在第四天和第45天取样分析的。在这些样地中没有发现可评估的疾病。产量是在1999年10月7日测量的。在这些处理情况之间没有发现产量差别。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝1951.141；SD＝555.345；CV＝2.24；处理概率(F)＝0.0125。
表8
斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有
显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
B)Garst 261 RR是在位于宾夕法尼亚州的Waterford的Port农场的田地里种植的。是于2000年6月24日在R1的早期使用制剂的。大豆是于1999年10月6日收割的。在这些样地中没有发现可评估的疾病。产量是在1999年10月7日测量的。在这些处理情况之间没有发现产量差别。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝3025.34；SD＝l334.75；CV＝7.4；处理概率(F)＝0.6493。
表9斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
C)Group 1.9 RR是在位于宾夕法尼亚州的Waterford的Port农场的田地里种植的。是在1999年6月24日在R1的早期使用制剂的。大豆是于1999年10月6日收割的。在这些样地中没有发现可评估的疾病。产量是在1999年10月7日测量的。在这些处理情况之间没有发现产量差别。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝2536.3；SD＝721.9；CV＝3.57；处理概率(F)＝0.6225。
表10斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
D)Pioneer 93B01 RR是在位于俄亥俄州MT.Vernon的Springer农场的田地里种植的。是在1999年6月30日在R1的早期使用制剂的。大豆是于1999年10月26日收割的。有Phytophthoram的存在，并且是于1999年9月2日鉴定的。Cobra处理显著的降低了Phytophthora的发生率，并且显著增加了产量。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝3835.87；SD＝1919.86；CV＝9.36；处理概率(F)＝0.153。
表11斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
E)Pioneer 93B01 RR是在位于俄亥俄州MT.Vernon的Springer农场的田地里种植的。是在1999年6月30日使用制剂的。大豆是于1999年10月26日收割的。有Phytophthora m的存在，并且是于1999年9月2日鉴定的。Cobra处理显著的降低了Phytophthora的发生率，并且显著增加了产量。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝4189.86；SD＝2097.06；CV＝10.47；处理概率(F)＝0.2878。
表12斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
F)Ohio FG1是在位于俄亥俄州Vab Wert的Profit农场的田地里种植的。是在2000年7月20日使用制剂的。大豆是在正常生长季节的后期收割的。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝524.66；SD＝233.18。
表13斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
G)Ohio FG1是在位于俄亥俄州的Vab Wert的Profit农场的田地里种植的。是在2000年7月130日使用制剂的。大豆是在正常生长季节的后期收割的。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝407.05；SD＝180.91。
表14斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)H)Ohio FG1是在位于俄亥俄州的Vab Wert的Profit农场的田地里种植的。是在2000年7月10日使用制剂的。大豆是在正常生长季节的后期收割的。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝1137.79；SD＝505.68。
表15斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
I)Ohio FG1是在位于俄亥俄州Vab Wert的Profit农场的田地里种植的。是在2000年7月10日使用制剂的。大豆是在正常生长季节的后期收割的。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝1355.94；SD＝602.64。
表16
斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有
显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
J)Pioneer 9305是在位于俄亥俄州St.Charles Seminary，Coldwater的田地里种植的。是在2000年7月1日使用制剂的。大豆是在正常生长季节的后期收割的。对于总异黄酮，如下计算LSD(P＝0.05)＝296.53；SD＝131.79。
表17
斜体字表示的制剂是对照组。后边跟有相同字母的均值没有
显著的差别(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
虽然本发明已经做了很详细的描述，而且参考其中的特殊实施例，对本领域的技术人员来说显而易见，在此处做一些各种变化和修改都不会背离本发明的宗旨和范围。
权利要求
1.一种在植物体内触发诱导性系统抗性的方法，其中包括将有效数量的含有二苯醚的具有生物学活性的制剂应用于植物体的至少一部分表面，在植物体内触发诱导性系统抗性的活性，从而诱导出针对至少一种病原体或疾病的系统性抗性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述二苯醚具有用下述分子式中之一表示的结构
其中R1是氢原子、氟原子或氯原子，或三氟甲基基团；R2、R3和R5独立的是氢原子、氟原子或氯原子；R4是氢原子，NR6、NR6R6、CR6、COOR6、COOCHR6CO2R6、CONHSO2R6或环醚，其中R6是氢原子、具有1～4个碳原子的支链烷基基团或具有1～4个碳原子的直链烷基基团；
其中R7是氧或氮原子；R8是氢原子、CH3、含有2～5个碳原子的脂肪链或HSO2CH3；和
其中R9是H、Cl、I、Br、CF3，R10是含有1～5个碳原子的支链脂肪链。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述二苯醚具有如分子式(I)表示的结构。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述二苯醚是氟锁草醚、苯草醚、治草醚、氯硝醚、草枯醚、消草醚、乙羧氟草醚、氟草醚、氟黄胺草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、乳氟禾草灵、除草醚、硝氟草醚或乙氧氟草醚。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述二苯醚是乳氟禾草灵。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述制剂进一步包括一种或多种选择植物学上可以接受的载体、作物油浓缩物、表面活性剂、肥料、乳化剂、分散剂、起泡剂、消泡剂和掺合剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述佐剂是表面活性剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述佐剂是非离子表面活性剂。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述佐剂是作物油浓缩物。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述佐剂是硫酸铵或尿素硝酸铵。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述制剂进一步包括一种或多种其它的活性化合物。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种其它的活性化合物是除草剂。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述植物体是选择利马豆、斑豆或大豆的豆科植物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述豆科植物是大豆。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导性系统抗性是在由所述病原体引起的疾病发作之前被激发的。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导性系统抗性一直持续到植物收获时。
17.如权利要求1所述的方法，其中进一步包括将所述制剂在首次施用后，施用于植物体表面的增强施用，从而诱导针对病原体的连续抗性。
18.一种增加植物产量的方法，其中包括将有效数量的含有二苯醚的具有生物学活性的制剂应用于植物体的至少一部分表面，在植物体内触发诱导性系统抗性的活性，并且维持或增加植物体总体健康状况，从而增加农作物产量。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述二苯醚具有用下述分子式中之一表示的结构
其中R1是氢原子、氟原子或氯原子，或三氟甲基基团；R2、R3和R5独立的是氢原子、氟原子或氯原子；R4是氢原子、NR6、NR6R6、CR6、COOR6、COOCHR6CO2R6、CONHSO2R6或环醚，其中R6是氢原子，具有1～4个碳原子的支链烷基基团或具有1～4个碳原子的直链烷基基团；
其中R7是氧或氮原子；R8是氢原子、CH3、含有2～5个碳原子的脂肪链或HSO2CH3；和
其中R9是H、Cl、I、Br、CF3，R10是含有1～5个碳原子的带支链的脂肪链。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述二苯醚具有如分子式(I)表示的结构。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述二苯醚是氟锁草醚、苯草醚、治草醚、氯硝醚、草枯醚、消草醚、乙羧氟草醚、氟草醚、氟黄胺草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、乳氟禾草灵、除草醚、硝氟草醚或乙氧氟草醚。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述二苯醚是乳氟禾草灵。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述制剂进一步包括一种或多种选择植物学上可以接受的载体、作物油浓缩物、表面活性剂、肥料、乳化剂、分散剂、起泡剂、消泡剂和掺合剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述佐剂是表面活性剂。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述佐剂是非离子表面活性剂。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述佐剂是作物油浓缩物。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述佐剂是硫酸铵或尿素硝酸铵。
28.如权利要求18所述的方法，其中所述制剂进一步包括一种或多种其它的活性化合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种其它的活性化合物是除草剂。
30.如权利要求18所述的方法，其中所述植物体是选自利马豆、斑豆或大豆的豆科植物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述豆科植物是大豆。
32.如权利要求18所述的方法，其中所述诱导性系统抗性是在由所述病原体引起的疾病发作之前形成的。
33.如权利要求18所述的方法，其中所述诱导性系统抗性一直持续到植物收割时。
34.如权利要求18所述的方法，其中进一步包括将所述制剂在首次施用后，施用于植物体表面的增强施用，从而诱导针对病原体的连续抗性。
35.一种增加植物体内异黄酮水平的方法，其中包括将有效数量的含有二苯醚的具有生物学活性的制剂应用于植物体的至少一部分表面，诱导异黄酮在植物体中的释放和产生，从而增加植物体内的异黄酮水平。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述二苯醚具有用下述分子式中之一表示的结构
其中R1是氢原子、氟原子或氯原子或三氟甲基基团；R2、R3和R5独立的是氢原子、氟原子或氯原子；R4是氢原子、NR6、NR6R6、CR6、COOR6、COOCHR6CO2R6、CONHSO2R6或环醚，其中R6是氢原子，具有1～4个碳原子的支链烷基基团或具有1～4个碳原子的直链烷基基团；
其中R7是氧或氮原子；R8是氢原子、CH3、含有2～5个碳原子的脂肪链或HSO2CH3；和
其中R9是H、Cl、I、Br、CF3，R10是含有1～5个碳原子的支链脂肪链。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述二苯醚具有如分子式(I)表示的结构。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述二苯醚是氟锁草醚、氟黄胺草醚或乳氟禾草灵。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述二苯醚是乳氟禾草灵。
40.如权利要求35所述的方法，其中所述制剂进一步包括一种或多种选择植物学上可以接受的载体、作物油浓缩物、表面活性剂、肥料、乳化剂、分散剂、起泡剂、消泡剂和掺合剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述佐剂是表面活性剂。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述佐剂是非离子表面活性剂。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述佐剂是作物油浓缩物。
44.如权利要求40所述的方法，其中所述佐剂是硫酸铵或尿素硝酸铵。
45.如权利要求35所述的方法，其中所述制剂进一步包括一种或多利其它的活性化合物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述一种或多种其它的活性化合物是除草剂。
47.如权利要求35所述的方法，其中所述植物体是选自利马豆、斑豆或大豆的豆科植物。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述豆科植物是大豆。
49.一种增加植物体内异黄酮水平的方法，其中包括将含有植物学上可接受的载体和有效数量的含有如分子式(II)所示二苯醚的组合物应用于植物体；
其中R7是氧或氮原子；R8是氢原子、CH3、含有2～5个碳原子的脂肪链或HSO2CH3。
全文摘要
本发明涉及一种在植物体内诱导系统性抗性的方法，从而保护植物体免受宽范围的病原体和疾病的侵犯。本发明所述方法包括将含有二苯醚的具有生物学活性的制剂应用于植物体。根据本发明，已经观察到该制剂的使用会在靶植物体内产生诱导性系统抗性。而且根据本发明所述方法，所述制剂已经表现出在植物体内触发针对许多病原体和疾病的长期的、非专一性的系统性抗性。进一步而言，本发明所述方法会导致植物体异黄酮水平的增加。
文档编号A01N43/16GK1398159SQ01804740
公开日2003年2月19日 申请日期2001年2月12日 优先权日2000年2月11日
发明者W·J·阿达, N·P·巴登豪普, A·D·施塔门, T·G·比恩, T·L·格雷厄姆, L－M·Y·格雷厄姆, S·兰迪尼 申请人:瓦伦特美国公司, 俄亥俄州立大学研究基金会