奇蒿提取物3,4-二羟基肉桂酸的制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体是指在奇蒿中提取3, 4-二羟基肉桂酸以及它在 制备抗菌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 菊科艾属植物奇蒿Artemisia anomala S. Moore的地上干燥部分，多年生草本植 物，全草显黄酮苷反应。产于江苏南部，生长于山坡、路边及林缘。分布于华东、中南及西南 各省区。又名南刘寄奴、金寄奴、六月霜（浙江、江西）、野马兰头（浙江）、九牛草（湖南）、 苦速婆/苦婆菜（福建）、六月雪/六月霜（安徽、江西、湖南）、大叶蒿、铁杆茵陈（江苏）， 其性味辛、苦、平。始载于南北朝的《雷公炮制论》，以后历代主要本草如《唐本草》、《证类本 草》、《本草纲目》和《中华本草》等均有收载。中医认为奇蒿具有清利湿热、活血化瘀、通经止 痛，解毒消肿的功效。最新研究显示奇蒿还具有抗炎，抗氧化，抗硝化，抗血小板聚集， 促血管舒张，通过多靶点调节以抑制血管炎症的功效.更有学者发现其对HSV(单纯疱疹 病毒）也有良好的治疗效果（Zheng M. Experimental study of 472 herbs with antiviral action against the herpes simplex virus. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 1990 Jan ； 10(1) :39-41, 6. Chinese.).现代临床实践发现奇蒿可治疗急性细菌性痢疾，腹泻，烧伤， 跌打损伤，蛇咬伤，早期乳痈等疾病，这些提示奇蒿可能对多种致病菌具有抑制作用，可 以预防和治疗感染。刘运徳等已研究发现奇蒿具有很好的抗真菌效果.既往采用奇蒿全草 入药（水煎液或者浓缩片剂）进行临床治疗和抗菌实验，难以分析奇蒿的有效抗菌成分的 来源。
[0003] 既往研究或临床实践采用奇蒿全草入药（水煎液或者浓缩片剂等）进行临床治 疗和抗菌实验，难以分析奇蒿的有效抗菌成分的来源，因此，申请者近年来对奇蒿进行系统 性分离提取，然后以80%乙醇提取物及各极性部位进行体外抗菌实验，分析奇蒿有效抗菌 成分的来源，为下一步提取纯化物建立了一定的基础。申请人的前期研究发现：奇蒿不同 提取物对临床多种致病菌表现出了良好的杀菌作用。例如：（1)乙酸乙酯提取物对福氏志 贺菌、痢疾志贺菌和无乳链球菌的最小杀菌浓度均为6. 25mg/mL，而对大肠正常菌群无抑 制作用。其中志贺菌属是引起细菌性痢疾的最主要致病菌，细菌性痢疾也是野战和抢险 救灾时，部队最易广泛发生的疾病之一。而无乳链球菌通常被称为B群链球菌（group B streptococcus, GBS)，属条件性致病菌。目前，治疗GBS感染，可供选择的药物较多[9]。 然而，在特殊情况下，例如发生大规模自然灾害或者爆发战争，因缺少药品仍可能出现GBS 感染的大量爆发，妊娠期妇女生殖泌尿系统感染GBS，可引发胎膜早破、早产、死胎、宫内感 染等一系列妊娠并发症，产妇感染GBS可导致产后子宫内膜炎、盆腔炎乃至败血症；新生 儿感染GBS可导致肺炎、败血症和脑膜炎。（2)氯仿提取物对大肠埃希氏菌具有良好的杀 菌作用，最小杀菌浓度为6. 25mg/mL，大肠埃希氏菌是人体肠道内的正常寄殖菌，战时腹部 受到外伤后，若肠道破裂或者穿孔可引起肠道大肠埃希菌移位，从而导致腹腔感染，乃至 全身性感染，也可因战伤导致机体抵抗力严重下降而感染。第二军医大学第三附属医院资 料显示：大肠埃希菌是院内感染病原菌检出率最高的菌种，约占院内感染检出细菌株总数 的28. 3-34. 6% ;而在胆道感染中所占的比例更高，检出率在50%以上。近年来，抗生素滥 用，导致大肠埃希菌耐药率居高不下，程训民等[12]在124株大肠埃希菌中共检出54株 (4 3·5% )产超广谱 β-内醜胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)。现有抗 生素常无效，因此亟需开发新型抗生素替代。（3)氯仿和乙酸乙酯提取物均对金黄色葡萄球 菌具有良好的杀菌作用，最小杀菌浓度均为12. 5mg/mL。金黄色葡萄球菌是开放性外伤最常 见的污染细菌，也是战时开放性污染创面的最常见致病细菌。
[0004] 奇蒿广泛生长于华东、中南和西南地区，原料分布区域广大，取材方便。华东、中南 和西南地区分别为南京军区，广州军区和成都军区的辖区。在军事上以上三个地区均面对 着极为错综复杂的国际或者国内形势，例如南京和广州军区一方面需要做好对台军事斗争 的准备，另一方面需要面对来自日本和东南亚诸国对我国东海及南海的岛屿及海底资源的 争夺。而成都军区方面需要面对和藏独势力的长期斗争，同时也要对印度采取防范。因此 以上三个军区都存在应对局部战争的可能。在和平时期，以上三个地区均为自然灾害的高 发区域，例如：华东及中南地区为洪涝灾害的高发区域，西南地区为地震，泥石流等地质灾 害的高发区域，需要应对可能发生的大范围的自然灾害。因此，深入研究奇蒿的抗菌活性成 分，开发价廉质优的高效抗生素，既有利于战争和大规模自然灾害发生时，利用其原料分布 区域广泛的特点，保障军队和人民群众短期内集中使用抗生素治疗相应细菌感染的需要， 也能有效满足平时人民群众一般抗菌治疗的需求。
[0005] 申请号为201110187502. 6,公开号为CN102309533A的中国专利申请一种奇蒿总 黄酮的制备方法，该方法主要采用超临界二氧化碳流体萃取法萃取奇蒿粉末，乙醇作为携 带剂，萃取物采用大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱，减压浓缩，冷冻干燥得到奇蒿总黄酮。其制 备方法简单，快捷，无毒。但是该方法是针对奇蒿总黄酮的制备方法，不便于奇蒿单体活性 成分的提取制备，因此发明对奇蒿中单体活性成分的制备方法具有重要意义。
[0006] 本发明人一直致力于对奇蒿进行系统性分离提取，并完成了不同提取物及各极 性部位进行的体外抗菌实验，通过体外抗菌实验筛选出奇蒿有效抗菌成分的来源，并完成 了抗菌有效单体的分离与鉴定。
【发明内容】
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种奇蒿提取物3, 4-二羟基肉桂酸的制备方法。
[0008] 本发明的目的在于提供一种奇蒿提取物3, 4-二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的 应用。
[0009] 奇蒿提取物3, 4-二羟基肉桂酸（咖啡酸）的制备方法，按照下述步骤进行：
[0010] 将干燥奇蒿原药材粉碎后浸泡在80 %乙醇中，65°C渗漉提取，提取结束后薄膜蒸 发，干燥后待用，得80%乙醇提取物干燥粉末；其中奇蒿原药材与80%乙醇的用量比例为 1:5kg/L〇
[0011] 取80%乙醇提取物干燥粉末1kg，用6L石油醚浸泡24h过滤，滤渣干燥后用6L乙 酸乙酯浸泡24h过滤，滤液浓缩得乙酸乙酯提取物约6. 2kg。乙酸乙酯粗提物用甲醇溶解 后上硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯系统以：10:1、5:1、2:1、1:1、1: 2、1: 5、1:10各配置400ml 以2d/s (滴/秒）梯度洗脱，每隔30min收集一次样品，洗脱时间在23. 5h-25. 5h内收集得 到的第48号到第51号样品为3, 4-二羟基肉桂酸（咖啡酸）。
[0012] 在洗脱收集的96个样品中，通过薄层色谱点样法将含同种物质的样品混合，混合 后的样品通过旋转蒸发仪浓缩成提取液再通过真空离心蒸发浓缩器制成干粉状物（部分 为胶状物），所有样品保存在1. 5mL的EP管中，C〇60灭菌待用。
[0013] 薄层色谱点样法，参照：孙毓庆，胡育柱.分析化学.北京：科学出版 社，2007. 467 ~470。
[0014] 其中3, 4-二羟基肉桂酸（咖啡酸）的结构式为：
[0015]
[0016] 奇蒿提取物3, 4-二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的应用。
[0017] 其中所述菌株为无乳链球菌（Streptococus agalactiae，SA)临床型03598276、 福氏志贺菌（Shigella flexneri，SF)临床型03475491、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium，ST)临床型 5002324172。
[0018] 无乳链球菌（Streptococus agalactiae，SA)临床型 03598276、福氏志贺菌 (Shigella flexneri，SF)临床型 03475491、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium，ST) 临床型5002324172均来源于长海医院检验科临床分离获得的致病菌株，也可购自中科院 药物研究所。
[0019] 金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus, SA)