淫羊藿总黄酮在干预肠道屏障功能障碍中的应用

淫羊藿总黄酮在干预肠道屏障功能障碍中的应用
【技术领域】
[0001]本发明提供一种淫羊藿总黄酮在制药中的应用，具体是在制备抑制肠道屏障功能丧失的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]衰老的一个共同特点是细胞完整性逐渐丧失，最终导致组织功能障碍及机体的死亡，而维持能量代谢平衡、增强应激抵抗能力可延长机体寿命。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是细胞内维持能量代谢稳态平衡的主要能量传感器，衰老过程中AMPK活性逐渐减弱。近来有研究显示，AMPK可调节多条信号通路，包括增强自噬以及抗应激。研究还发现应激抵抗因子如核因子E2相关因子(Nrf2)和长寿信号通路如Fox03a、SIRTl又可调节自噬。因此，AMPK可能通过联系多条信号通路网络参与调节衰老过程。
[0003]肠道是机体中最大的细菌库，而肠道的上皮完整性是营养吸收及保护肠道免受感染所必需的。上皮屏障功能主要由相邻细胞间紧密连接蛋白所维持。大量研究报道，衰老大鼠、果蝇肠道上皮的结构、功能出现损伤，而且果蝇的肠道屏障功能受损可以提示其机体衰老开始。此外肠道屏障功能障碍可能会引起远远超出肠道范围的严重后果(Rera et al.，2013)。新近研究显示，肠道是重要的靶器官之一，在线虫及果蝇肠道中通过对其基因进行干预可延长个体寿命值得研究的是，AMPK及长寿信号通路活性减弱可调节紧密连接蛋白的表达，参与肠道屏障功能损伤。
[0004]淫羊藿首次在神农本草经中出现报道，在中国的使用已经超过了2000年，在中国及日本、韩国、意大利等其它国家均有广泛分布。淫羊藿总黄酮是从淫羊藿属植物分离出的一种主要成分，具有抗炎、抗癌、心肌保护等功效，在亚洲国家广泛用于治疗衰老相关疾病。淫羊藿总黄酮可转化为淫羊藿次苷1、淫羊藿次苷Π、淫羊藿苷。近来多种疾病中的研究显示，淫羊藿次苷可抑制mTOR信号通路、上调SIRTl的表达、使Foxo3去乙酰化。此外，已经开始有研究淫羊藿苷对肠道疾病作用的报道。我们已发表的研究显示淫羊藿总黄酮可通过上调S0D3及GPXl而降低环磷酰胺诱导的雄性小鼠生殖系统的氧化损伤。

【发明内容】

[0005]本发明提供一种淫羊藿总黄酮在制备抑制肠道屏障功能丧失的药物中的应用。淫羊藿总黄酮是通过促进抗氧化应激及长寿相关信号通路的表达而调节衰老肠道屏障功能障碍。
[0006]所述的促进抗氧化应激表达包括促进肠道claudin-Ι和occludin的表达。所述的促进抗氧化应激表达还包括促进肠道P-Thr 172-AMPK的表达。所述的促进抗氧化应激表达还包括促进肠道LC3-1I和Beclinl的表达。所述的促进长寿相关信号通路的表达包括促进肠道Nrf2及HO-1信号通路的表达。所述的促进长寿相关信号通路的表达还包括促进SIRTl及PGC-1a的表达。
[0007]淫羊藿总黄酮购自于中国成都仁诚生物科技有限公司，样品凭证存放于三峡大学医学院中草药研究所。采用HPLC-ELSD分析方法，淫羊藿总黄酮的含量达到89.58% (Yuanet al.,2014)。
[0008]成年雄性SD大鼠购自于三峡大学动物中心。大鼠饲养于温度及湿度受控的空间，12h、12h明暗交替，自由进食。40只大鼠饲养至18月龄后随机划分成衰老对照组(12只)、淫羊藿组(36只)。淫羊藿组从18月龄开始每天给予口腔灌胃淫羊藿总黄酮，浓度分别为10、20、60mg/kg，连续给药6个月。9月龄大鼠作为成年对照组(12只)。
[0009]大鼠处死后，获得肠道标本。收集新鲜小肠样本并于液氮中冷冻后，-80°C存放。小段肠组织(大约Icm)采用福尔马林固定。
[0010]免疫组织化学检测石蜡包埋后，组织切片，与特定的一抗标记。所有一抗购自于Santa Cruz(CA,USA)，SIRTl(MiIlipore,Bedford，MA,USA)，Fox03a(Abeam,Cambridge ,UK)，Nrf2(Abcam，Cambridge，UK)除外。免疫组化半定量的结果基于每组三只大鼠切片的均值。每只大鼠分析三张片子。使用光学显微镜((Olympus,Shanghai ,China)采集图片。
[ΟΟ??] Western blot各组织总蛋白(40ug)采用SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝胶电泳)分离后转移至PVDF膜。将膜用特定的一抗孵育。洗去一抗后，与HRP结合的IgG孵育。采用化学发光试剂盒检测膜上的蛋白。采用Image J进行分析蛋白相对量。
[0012]数据用mean土SEM表示。采用SPSS进行统计分析。数据采用单因素方差分析。卩〈
0.05可视为统计学上具有显著性差异。
【附图说明】
[0013]图1淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠紧密连接蛋白表达的影响。
[0014]图2淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠AMPK活性的影响。
[0015]图3淫羊藿总黄酮对自然衰老大鼠空肠自噬体形成的影响。
[0016]图4淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠Nrf2信号通路表达的影响。
[0017]图5淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠SIRTl、PGC_la表达的影响。
[0018]图6淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠Fox03a表达的影响。
【具体实施方式】
[0019]淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠紧密连接蛋白表达的影响
[0020]为了确定衰老大鼠肠道屏障是否受损，我们采用免疫组织化学检测空肠claudin-1和occludin的表达。如图1所示，成年大鼠肠道claudin-Ι和occludin的表达明显。相反，衰老大鼠肠道claudin-Ι和occludin表达显著减少。结果表明，衰老大鼠肠道屏障功能受损。然而，采用淫羊藿总黄酮治疗衰老大鼠肠道，尤其是高剂量组增加小肠二者的表达，表明淫羊藿总黄酮可调节衰老大鼠肠道屏障功能障碍。
[0021 ]淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠AMPK活性的影响
[0022]为证实不同年龄大鼠小肠AMPK的活性不同，我们检测空肠AMPK催化亚基的苏氨酸172磷酸化位点。结果显示，成年大鼠小肠P-Thr 172-AMPK表达较高，而衰老大鼠小肠P-Thrl72-AMPK显著减少，表明衰老大鼠AMPK活性降低。然而，淫羊藿总黄酮治疗衰老大鼠能显著增加小肠P-Thrl72-AMH(的表达，表明淫羊藿总黄酮对肠道屏障功能的影响可能与AMPK活性增加。Western blot的结果与免疫组化的结果类似。
[0023]淫羊藿总黄酮对自然衰老大鼠空肠自噬体形成的影响
[0024]AMPK不仅是能量感受因子，而且参与细胞内受损结构的自噬过程。为了进一步探究不同年龄组大鼠自噬体的数量是否发生变化，我们检测小肠自噬体形成过程中的LC3-1I和Beclinl蛋白水平。结果表明，衰老组小肠LC3-1I和Beclinl的表达降低，淫羊藿总黄酮组显著逆转上述效应。
[0025]淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠Nrf2信号通路表达的影响
[0026]AMPK可能通过抑制应激而增强组织应激抵抗能力。然而Nrf2是机体抗氧化应激的重要调节子，其可调节HO-1的表达。为了观察衰老大鼠小肠氧化应激稳态是否紊乱，我们检测空肠Nrf2、H0-l的表达。正如预期，衰老组小肠与成年组相比，Nrf2、H0-l的表达水平减少。同时，淫羊藿总黄酮组显著增加衰老大鼠小肠Nrf2及HO-1的表达。
[0027]淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠SIRTl、PGC_la表达的影响
[0028]AMPK与SIRTl之间的相互作用非常复杂，两者都是关键的能量感受因子，可延长寿命。此外，SIRTI还可调节抗应激能力，活化下游蛋白如PGC-1。如图5所示，衰老大鼠小肠SIRTl及PGC-1a的表达与成年组相比较显著降低。然而，与衰老组比较，淫羊藿治疗能显著增加小肠两个蛋白的表达。
[0029]淫羊藿总黄酮对衰老大鼠空肠Fox03a表达的影响
[0030]Fox03a是另外一个关键的长寿因子，也可被AMPK活化。为了证实不同年龄组大鼠Fox03a是否发生改变，我们通过免疫组织化学方法检测Fox03a的表达水平。我们的结果显示衰老大鼠与成年组大鼠相比，小肠Fox03a的表达水平降低，淫羊藿总黄酮治疗衰老大鼠能显著增加小肠Foxo3a的表达。
【主权项】
1.一种淫羊藿总黄酮在制备抑制肠道屏障功能丧失的药物中的应用。2.权利要求1所述的应用，其特征在于，淫羊藿总黄酮是通过促进抗氧化应激及长寿相关信号通路的表达而调节衰老肠道屏障功能障碍。3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的促进细胞紧密连接蛋白表达包括促进肠道 c laudin-1 和occ Iudin 的表达。4.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的促进长寿基因表达还包括促进肠道P-Thrl72-AMPK，SIRTl 及 PGC-1a 的表达。5.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的促进自噬相关蛋白表达还包括促进肠道LC3-1I 和 Beclinl 的表达。6.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的促进抗氧化相关信号通路的表达包括促进肠道Nrf2及HO-1信号通路的表达。
【专利摘要】本发明涉及淫羊藿总黄酮在干预肠道屏障功能障碍中的应用。具体为淫羊藿总黄酮在制备抑制肠道屏障功能丧失的药物中的应用。淫羊藿总黄酮是通过促进抗氧化应激及长寿相关信号通路的表达而调节衰老肠道屏障功能障碍。所述的促进细胞紧密连接蛋白表达包括促进肠道claudin-1和occludin的表达。
【IPC分类】A61P39/06, A61P1/00, A61K36/296
【公开号】CN105641015
【申请号】
【发明人】袁丁, 张长城, 顿耀艳, 王婷, 刘朝奇, 周志勇, 赵海霞
【申请人】三峡大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月20日