一种用于双分子荧光互补研究的表达载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于双分子荧光互补研究的表达载体及 其应用。
【背景技术】
[0002] 双分子焚光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC)技术最 早于2002年报道，是一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技 术。该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋 白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用。如果2个目标蛋白质之间没有相互作用， 则不能被激发产生荧光。
[0003] 目前，各种BiFC系统已经被广泛用于各种蛋白质的相互作用，并且在大肠杆菌、 真菌、酵母、哺乳动物细胞和植物细胞等多种体系中得到应用。目前BiFC使用的载体普遍 为2个载体，分别带有荧光蛋白分割成的2个分子片段。但在植物研究中，常用的基因转化 方式为农杆菌介导，其操作一般为一次转化一个载体。
[0004] 为了满足构建植物双元表达载体和农杆菌转化的要求，Citovsky构建了一系列 BiFC载体，其荧光蛋白表达框的两端带有稀有酶切位点，通过酶切一连接可将2个表达框 克隆到与之配套的PRCS植物双元表达载体中，用于农杆菌转化。虽然这种方法可满足农杆 菌转化的要求，但需要多次酶切和连接反应，整个过程十分繁琐。Grefen和Blatt建立了 一套2inl的BiFC技术，此技术中2个荧光蛋白片段的表达框架整合在一个载体上，通过 Gateway克隆使两个目标蛋白片段同时克隆在载体上。但是Gateway克隆需要使用商业化 的试剂盒，价格非常昂贵，并且Gateway克隆需要将基因克隆到入门载体和目标载体两个 克隆步骤。
[0005] 因此，有必要提供一种新的低成本、便捷的蛋白相互作用研究的方法。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于双分子荧光互补研究的表达载体及 其应用。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种用于双分子荧光互补研究的表达载体，包括第一目 的基因表达框和第二目的基因表达框，所述第一目的基因表达框包括第一启动子、荧光蛋 白N端基因编码序列、与荧光蛋白N端基因编码序列相连的GG克隆框、第一终止子，所述荧 光蛋白N端基因编码序列及与荧光蛋白N端基因编码序列相连的GG克隆框插入第一启动 子和第一终止子之间；
[0008] 所述第二目的基因表达框包括第二启动子、荧光蛋白C端基因编码序列、与荧光 蛋白C端基因编码序列相连的GG克隆框、第二终止子，所述荧光蛋白C端基因编码序列及 与荧光蛋白C端基因编码序列相连的GG克隆框插入第二启动子和第二终止子之间；
[0009] 其中，所述的GG克隆框包括顺次连接的BsaI酶切位点、SfiI酶切位点、CCdB基 因、SfiI酶切位点、BsaI酶切位点。
[0010] 优选地，所述第一目的基因表达框中，GG克隆框连接在荧光蛋白N端基因编码序 列的上游或下游。
[0011] 优选地，所述第二目的基因表达框中，GG克隆框连接在荧光蛋白C端基因编码序 列的上游或下游。
[0012] 优选地，所述第一或第二目的基因表达框中，第一或第二目的基因通过Golden Gate克隆插入到GG克隆框的BsaI酶切位点之间。
[0013] 优选地，所述第一或第二目的基因表达框中，第一或第二目的基因通过闭环 Gibson拼接插入到GG克隆框的SfiI酶切位点之间。
[0014] 优选地，所述GG克隆框进一步优选为SEQUENCE NO. 1所示核苷酸序列。
[0015] 优选地，所述第一启动子和第二启动子启动基因表达的能力相当。
[0016] 进一步优选地，所述第一启动子为35S启动子。
[0017] 进一步优选地，所述第二启动子为35S启动子。
[0018] 优选地，所述第一终止子为35S poly(A)终止子。
[0019] 优选地，所述第二终止子为35S poly(A)终止子。
[0020] 优选地，所述第一目的基因表达框和第二目的基因表达框通过氯霉素抗性基因相 连。
[0021] 优选地，所述第一目的基因表达框和第二目的基因表达框启动基因表达的方向相 同或相反。
[0022] 优选地，所述用于双分子荧光互补研究的表达载体为第一目的基因表达框和第二 目的基因表达框插入PGreen载体的多克隆位点所得的重组载体。
[0023] 进一步优选地，所述pGreen载体的多克隆位点为pGreen-0029的EcoRI和 HindIII 位点。
[0024] 优选地，所述第一目的基因为番木瓜eIF4E基因，第二目的基因为番木瓜 PRSV-Vpg 基因。
[0025] 本发明采用的pGreen为高拷贝的含T-DNA序列的植物表达载体，可同时用于植物 的瞬时和稳定表达。
[0026] 本发明提供的用于双分子焚光互补研究的表达载体含有的GG克隆框包括BsaI 酶切位点、SfiI酶切位点的克隆框，可同时用于Golden Gate克隆和闭环Gibson拼接 法。此外，本发明提供的用于双分子荧光互补研究的表达载体（优选为PBiFC-GG-Cl或 pBiFC-GG-Nl)上整合有荧光蛋白2个片段（N端和C端）的表达框架，利用此载体进行BiFC 研究时只需构建和向细胞内导入一个载体。
[0027] 第二方面，本发明提供了一种基于双分子荧光互补的蛋白相互作用检测载体的构 建方法，包括如下步骤：
[0028] 1)在第一、第二目的基因的5'端及3'端分别加接头序列，分别获得含有接头序列 的第一目的基因和第二目的基因，其中，所述接头序列为用于Golden Gate克隆的接头序列 或用于Gibson拼接的接头序列；
[0029] 2)取如第一方面所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，将步骤（1)所得的 含有GoIden Gate克隆接头序列的第一目的基因和第二目的基因通过GoIden Gate克隆插 入到GG克隆框的BsaI酶切位点之间，获得所述检测载体；或
[0030] 3)取如第一方面所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，将步骤（1)所得的 含有Gibson拼接的接头序列的第一目的基因和第二目的基因通过Gibson拼接插入到GG 克隆框的SfiI酶切位点之间，获得所述检测载体。
[0031] 本发明提供的构建方法能兼容Golden Gate克隆或闭环Gibson拼接法，灵活度 高；2个目标蛋白的基因序列能通过一步反应（Golden Gate克隆或闭环Gibson拼接法）同 时克隆到载体，分别与荧光蛋白的2个片段融合表达。
[0032] 优选地，所述用于Golden Gate克隆的接头序列为SEQUENCE NO. 30-33所示核苷 酸序列。
[0033] 优选地，所述用于Gibson拼接的接头序列为SEQUENCE NO. 34-37所示核苷酸序 列。
[0034] 第三方面，本发明提供了一种试剂盒，包括了如第一方面所述的用于双分子荧光 互补研究的表达载体，还包括用于Golden Gate克隆或Gibson拼接的接头序列，及用于 Golden Gate克隆或Gibson拼接的酶、试剂。
[0035] 优选地，所述用于Golden Gate克隆的接头序列为SEQUENCE NO. 30-33所示核苷 酸序列。
[0036] 优选地，所述用于Gibson拼接的接头序列为SEQUENCE NO. 34-37所示核苷酸序 列。
[0037] 第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的用于双分子荧光互补研究的表达 载体或如第二方面所述的基于双分子荧光互补的蛋白相互作用检测载体的构建方法在检 测蛋白质相互作用中的应用。
[0038] 本发明的有益技术效果是：本发明将传统BiFC研究中的两个表达载体整合为一 个表达载体，2个目标蛋白的基因序列能通过一步反应（Golden Gate克隆或闭环Gibson拼 接法）同时克隆到载体，分别与荧光蛋白的2个片段融合表达；此外，本发明提供的载体以 pGreen为骨架，能同时用于瞬时和稳定表达。
【附图说明】
[0039] 图1为本发明实施例提供的GG克隆框结构示意图；
[0040] 图2为本发明实施例提供的pBiFC-GG-Cl和pBiFC-GG-Nl的结构示意图；
[0041] 图3为本发明实施例提供的pBiFC-GG-Cl和pBiFC-GG-Nl的酶切鉴定图；
[0042] 图4为本发明实施例提供的目标基因克隆到pBiFC-GG的不意图；
[0043] 图5为质粒pBiFC-GG-Nl-Golden和pBiFC-GG-Nl-Gibson转化原生质体后目的基 因表达及相互作用检验效果；
[0044] 图6为携带pBiFC-GG-Nl-Golden和pBiFC-GG-Nl-Gibson的农杆菌转化烟草叶片 后目的基因表达及相互作用检验效果。
【具体实施方式】
[0045] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。若无特殊说明，本 发明采用试剂均为行业内常规试剂。
[0046] 本发明实施例涉及序列如下表1所示：
[0047] 表1.本发明实施例涉及序列
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[0050] 实施例1构建用于双分子荧光互补研究的新型表达载体pBiFC-GG
[0051] 1)在传统 BiFC 载体 pSAT-cEYF