一种用于治疗心脏病的药物及其试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于治疗心脏病的药物及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 心脏病是心脏疾病的总称，包括风湿性心脏病、先天性心脏病、高血压性心脏病、 冠心病、心肌疾病等各种心脏病。心脏病是目前危害人类健康的主要疾病之一。
[0003] 心脏在受到各种生理刺激，组织损伤或者内分泌失调的情况下会产生肥厚性生长 以维持心脏血输出量。心肌肥厚在功能上是一个初始的适应性反应，但是持续的心肌肥厚 会导致心衰和猝死。心肌肥厚是一个复杂的病理过程，伴随着心肌细胞蛋白含量增加，胎儿 期基因重新表达，心肌细胞骨架重排。微丝骨架在心肌病的发病过程中发挥了重要的功能， 不仅参与维持细胞形态完整性和机械阻力，而且参与了胞外信号向胞内的传导以调节心肌 基因的表达和功能。
[0004] 已有研究表明，抑制TWF-1，能够有效的治疗心脏病，特别是心肌肥厚或心衰。因 此，开发一种TWF-I抑制剂对于治疗心脏病具有极好的应用前景。
[0005] 核酸适体（Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革El标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技 术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)从人工合 成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核 酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子 识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有 很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速 的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种特异结合TWF-I的核酸适体及其药物组合物。
[0007] 本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-13所示的单链DNA。
[0008] 所述核酸适体与TWF-I蛋白具有较好的亲和能力，并且抑制了 TWF-I蛋白的活性 位点，从而抑制其功能活性。
[0009] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0010] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种： a) 将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物； b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能 的核酸适体的衍生物； c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功 能的核酸适体的衍生物； d) 将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生 物； e) 将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有 相同功能的核酸适体的衍生物。
[0011] 所述核酸适体可用于制备TWF-I抑制剂的药物。
[0012] 利用本发明的核酸适体，可以特异性结合TWF-I蛋白，从而用于心脏病的治疗。利 用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用 价值。
【具体实施方式】
[0013] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0014] 实施例1、核酸适体的筛选和制备 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下： 5' -AACCTTGACTGCAACGTCA (N39)GGCACGTGACAGACGTCA-3' ；N39 代表 39 个随机核苷 酸。
[0015] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以 回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75 μ g RNA 文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug TWF-I蛋白（通过常规的 真核表达获得)，37° C孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪 碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L尿素，0· 55mol/L醋酸铵，1.5mmol/L EDTA，0. 15% SDS)中煮 沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ I DEPC水中；以RNA为模板 RT-PCR 扩增双链 DNA，引物为：AACCTTGACTGCAACGTCA 和 TGACGTCTGTCACGTGCC，体外转录出 RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模 板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行11轮。得到了 13个适配子，其序列分别为SEQ ID NO: 1-13所示。具体序列如下所示： TffF-I-I ： AACCTTGACTGCAACGTCATTATCAATCGCCATACCCATCCAGTAACCTCTCATACCTGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID N0:1) TffF-1-2 ： AACCTTGACTGCAACGTCAACAACAATCTGTACTCCACAATTCGAATCACTACATCATGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:2) TffF-I-3 ： AACCTTGACTGCAACGTCAATATTAACCGCCACTAATCTCCTCATCGCTACTATAACCGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:3) TffF-I-4 ： AACCTTGACTGCAACGTCATTCGCCTTATCCCTACAATCCATAAATCACGCAACACAAGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID N0:4) TffF-I-5 ： AACCTTGACTGCAACGTCAATACAACTACAACGCTCTATACATCTTGTATCAACACTAGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:5) TffF-I-6 ： AACCTTGACTGCAACGTCAACCCAATCACGACAACTTCAATCCACCACATAAGAATCTGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:6) TffF-I-7 ： AACCTTGACTGCAACGTCAACGCATACACCACCTTTACCTAATCCACGTTATATAACTGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:7) TffF-I-8 ： AACCTTGACTGCAACGTCATATCGCCCATCATCATTATCATCAAACGTTTACATACCAGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:8) TffF-I-9 ： AACCTTGACTGCAACGTCAATATATATTCTACCCCGTCTAAAACCAAAGACTCTTCAAGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:9) TffF-I-IO ： AACCTTGACTGCAACGTCATTATAACATTCAGAACTTTACTATTAATGCATCTCCATCGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:10) TffF-I-Il ： AACCTTGACTGCAACGTCATATCACACACCTACACCTCCTTATTCGCCAACTATTTATGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:11) TffF-1-12 ： AACCTTGACTGCAACGTCAATCGCCCTATCATCTCACTCGCCCTATCCACAATATTTAGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:12) TffF-1-13 ： AACCTTGACTGCAACGTCAATCGATCAACCTAATTATTTATCAACACAGTCACACCATGGCACGTGACAGACG TCA (SEQ ID NO:13) 实施例2 TWF-I蛋白结合适配子的性能测定 将RNA适配子分别取1.5 μ g，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37° C消化lh，纯化回收 去磷酸化的RNA ;通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P] ATP于去磷酸化的RNA分子末端。 IOnmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度（1-200ηΜ)的TWF-I 37° C孵育30min， 各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射 量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与Lp-PLA2的解离常数。结果如下表所示：
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实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，IgG蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，与13条适配 子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与TWF-I 蛋白结合保持较高的特异性。
[0016] 将所述的适配子，取0. 3ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过 RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0017] 实施例4所述适配子用于心脏病的治疗 首先用PE处理新生大鼠心肌细胞，诱导心肌细胞肥厚，然后将上述13个适配子按照常 规方法转染该细胞，以转染AACCTTGACTGCAACGTCA阴性对照心肌细胞作为对照。结果发现， 与对照组相比，13个适配子转染的细胞内TWF-I的表达显著下降，并且心肌细胞减小50%以 上。
[0018] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 核酸适体，其特征在于：能够与TWF-I蛋白特异性结合。2. 如权利要求1所述的核酸适体，其序列为序列表的序列1-13中任一所示。3. -种用于心脏病治疗的药物，其含有权利要求1-2任一项所述核酸适体以及药学上 可接受的载体。4. 权利要求1-2任一项所述核酸适体在制备治疗心脏病的药物中的应用。5. -种治疗心脏病的试剂盒，其包括权利要求1-2任一项所述的核酸适体。
【专利摘要】本发明公开了用于治疗心脏病的药物及其试剂盒。本发明提供的核酸适体，与TWF-1蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的TWF-1，将其制备成为相应的药物，将有利于心脏病疾病的治疗。
【IPC分类】A61K31/7088, A61P9/00, A61K48/00, C12N15/115
【公开号】CN105177012
【申请号】
【发明人】杜护侠
【申请人】杜护侠
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月25日