一株经分离获得的鞘氨醇单胞菌属细菌及其在促进连作西瓜生长中的应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一株鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonassp.)细菌及其在促进连作西瓜生长中的应用。本发明属于微生物
技术领域：
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背景技术：
】[0002]中国是世界上最大的西瓜产地，种植面积约占世界总种植面积的55%，并占世界总产量的70%以上。但是随着西瓜的连年种植，连作障碍已经成为我国西瓜栽培中重要瓶颈之一（柯用春，王爽，任红，等.强化还原处理对海南西瓜连作障碍土壤性质的影响[J].生态学杂志，2014,33(4):880-884;徐伟慧，吴凤芝，王志刚，等.连作西瓜光合特性及抗病性对小麦伴生的响应[J].中国生态农业学报，2014,22(6):655-660.)。通过增施化肥和农药等方法来缓解连作障碍具有高污染和高风险的缺点，近些年来，植物根际促生菌在缓解连作障碍上的研究正在兴起，有报道指出土壤经过不同种类微生物接种后能够有效增加植物生长所必需的各类营养元素（夏觅真，马忠友，曹媛媛，等.棉花根际固氮菌、解磷菌及解钾菌的相互作用[J].中国微生态学杂志，2010,22(2):102-105.)，促进有益微生物群落大量繁殖，抑制有害菌生长，减少病菌积累（马玲，马琨，汤梦洁，等.间作与接种AMF对连作土壤微生物群落结构与功能的影响[J].生态环境学报，2013,22(8):1341-1347.LEESW，LEESH，BALARAJUK，etal.Growthpromotionandinduceddiseasesuppressionoffourvegetablecropsbyaselectedplantgrowth-promotingrhizobacteria(PGPR)strainBacilussubtilis21-lundertwodifferentsoilconditions[J].ActaPhysiologiaePlantarumj2014,36(6):1353-1362.LANDABB,M0NTES-B0RREG0MjNAmS-CORTESJA.UseofPGPRforControllingSoilborneFungalPathogens：AssessingtheFactorsInfluencingItsEfficacy[M]//BacteriainAgrobiology：DiseaseManagement.SpringerBerlinHeidelberg，2013:259-292.)，帮助植物建立良好的根际生长条件（HAYATR，AHMEDI，SHEIRDILRA.Anoverviewofplantgrowthpromotingrhizobacteria(PGPR)forsustainableagriculture[M]//CropProductionforAgriculturalImprovement.SpringerNetherlands,2012:557-579.MEHTAPjWALIAAjCHAUHANAjetal.Plantgrowthpromotingtraitsofphosphate-solubilizingrhizobacteriaisolatedfromappletreesintransHimalayanregionofHimachalPradesh[J].Archivesofmicrobiology，2013,195(5):357-369.)，这些报道充分显示了微生物在防治连作障碍上的潜质D[0003]磷是植物生长所必须的重要营养元素之一（赵国杰，牛世全，达文燕，等.四株无机解磷菌处理碱化土壤的理化性质及质量评价[J].土壤通报，2014,45(4):996-1002.SINDHUSSjPHOURMjCH0UDHARYSRjetal.PhosphorusCycling：ProspectsofUsingRhizosphereMicroorganismsforImprovingPhosphorusNutritionofPlants[M]//GeomicrobiologyandBiogeochemistry.SpringerBerlinHeidelberg,2014:199-237.)?解磷菌能够将土壤中不能被植物吸收的有机磷转化为可被植物直接利用的有效磷，增加土壤含磷量（王光华，赵英，周德瑞，等.解磷菌的研究现状与展望[J].生态环境，2003,12(1):96-101.王志刚，徐伟慧，莫继先，等.东北黑土区大豆根际促生菌群落组成研究[J].中国生态农业学报，2012,20(5):592-596.)，促进植物磷摄取。此外，解磷菌在代谢过程中还能够分泌生长激素，促进植物生长，缓解连作导致的植株发育不良，为农作物产量的增大提供有利条件。[0004]本发明经筛选和鉴定得到了一株鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonassp.)细菌，其最大解磷量可达到642.60mg/L，IAA最大分泌量可达到22.87mg/L，此外，本发明还研究了其对连作西瓜幼苗生长的影响，以期为利用微生物缓解西瓜连作障碍提供技术支持。【
发明内容】[0005]本发明的目的之一是提供一株经分离获得的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonassp.)细菌，该细菌具有较高的解磷能力，能够优化西瓜根系形态，改善根系组成，可有效缓解西瓜连作障碍，对连作西瓜植株具有明显的促生效应；[0006]本发明的目的之二是提供所述分离获得的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonassp.)细菌在促进连作西瓜植株生长、缓解西瓜连作障碍中的应用。[0007]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：[0008]本发明的一株经分离获得的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonassp.)细菌，命名为Sphingomonassp.CLO1，分类命名为鞘氨醇单胞菌属CLO1，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCCNO:M2015198,保藏日期为2015年4月6曰。[0009]本发明发明人于2014年3月采集黑龙江省齐齐哈尔市某园林中的植物根际土壤，采用抖土法收集根系表面土壤，通过浓度梯度稀释，得到104、105、106浓度土壤悬液，平板涂布后，存放于28°C恒温箱内培养5d，挑取解磷圈较大的单菌落进行纯化。将纯化菌株制作种子液，按1%的接种量接入液体蒙金娜培养基，在28°C、120r/min的摇床中进行培养，取上清液通过钼锑抗比色法进行解磷能力的测定。对比各菌株解磷值，选取解磷能力最高的一株进行后续实验。结果显示，筛选后得到解磷能力最强的菌株CL01，鉴定为Sphingomonassp.，最大解磷量可达到642.60mg/L，IAA最大分泌量可达到22.87mg/L，经0D_nni=0.50和OD_ηηι=1.00浓度的菌液分别处理后，结果显示连作西瓜幼苗根干重、根长、根体积、根尖个数和毛根（〇.00mm<d彡0.50mm)比例均显著增加，根系平均直径均显著降低；相比较而言，使用浓度〇D_nni=0.50的菌液处理促进连作西瓜幼苗生长的效果更好，且用量少。[0010]因此，进一步的，本发明还提出了以上所述的鞘氨醇单胞菌属细菌Sphingomonassp.CLOl在促进连作西瓜生长、缓解西瓜连作障碍中的应用。[0011]其中，所述的促进连作西瓜生长以及缓解西瓜连作障碍主要包括增加幼苗的根干重、根长、根体积、根尖个数和毛根比例，以及降低根系平均直径等等。[0012]综上所述，经本发明分离获得Sphingomonassp.CLOl具有较高的解磷能力，可分泌IAA，且能够优化西瓜根系形态，改善根系组成，可有效缓解西瓜连作障碍，在缓解西瓜连作障碍方面具有较好的利用前景。【附图说明】[0013]图1为各菌株48h时水溶性磷含量；[0014]图2为Sphingomonassp.CLOl系统发育进化树；[0015]图3为Sphingomonassp.CLOl生长曲线（a)及接菌后IAA浓度变化（b);[0016]图4为不同处理西瓜根系形态扫描图谱。【具体实施方式】[0017]下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0018]实施例1菌株Sphingomonassp.CLOl的分离纯化和鉴定[0019]1材料与方法[0020]I.1培养基[0021]蒙金娜有机培养基（IL):葡萄糖10.00g，（NH4)2SO40·50g，MgSO4·7H200·30g，NaCl0.30g，KCl0.30g，FeSO4·7Η200.03g，MnSO4.H2O0.03g，卵磷脂0.20g，CaCO3I.00g，酵母粉〇.50g，琼脂20.00g，蒸馏水定容至1000.00ml，液体培养基不加琼脂。[0022]L2解磷菌株粗筛[0023]于2014年3月采集黑龙江省齐齐哈尔市某园林中的植物根际土壤，采用抖土法收集根系表面土壤，通过浓度梯度稀释，得到104、105、106浓度土壤悬液，平板涂布后，存放于28°C恒温箱内培养5d，挑取解磷圈较大的单菌落进行纯化。[0024]1.3解磷菌株解磷能力测定及筛选[0025]I.3.1磷含量标准曲线绘制[0026]分别将2μg/ml的磷标准液梯度稀释为含磷量为0.00μg/ml、0.04μg/ml、0·08μg/ml、0.24μg/ml、0.40μg/ml、0.80μg/ml、I.20μg/ml制作标准曲线。在室温下加入钼锑抗显色剂，显色20min，测得吸光值并制作标准曲线。测定标准曲线为y=0·5256χ+0·0359,相关系数R2=0·9945。[0027]1.3.2解磷能力测定与筛选[0028]对纯化菌株进行种子液制备，具体方法如下：使用接种环挑取纯化菌株的菌落接种于LB液体培养基中，在28°C、120r/min的条件下进行摇瓶培养，通过分光光度计测定菌液吸光值（〇D6_J，确定其对数生长期，使用对数生长期菌液作为种子液。[0029]按1%(v/v)的接种量将种子液接入液体蒙金娜培养基，在28°C、120r/min的摇床中进行培养。每隔24h取5.OOml菌悬液在4000r/min下离心20min，取上清液通过钼铺抗比色法进行解磷能力的测定。对比各菌株解磷值，选取解磷能力最高的一株进行后续实验。[0030]1.4菌株鉴定与生长曲线测定[0031]对筛选菌株进行形态和16SrDNA分类鉴定，采用Mega5.0制作进化树。挑取筛选菌株单菌落接种于100.0Oml液体蒙金娜培养基中，28°C，120r/min摇瓶培养，每4h测定吸光值（〇D6_J，制作菌株生长曲线。[0032]I.5IAA分泌量测定[0033]I.5.IIAA标准曲线测定[0034]标准曲线采用分析纯IAA进行制备，将50.00μg/ml的IAA标准液梯度稀释为0·00μg/ml、10.00μg/ml、20.00μg/ml、30.00μg/ml、40.00μg/ml、50.00μg/ml，测定标曲，得到标准曲线为y=0.0115x+0.003,相关系数R2=0.99当前第1页1 2