Ein2蛋白在抑制基因表达中的应用

Ein2蛋白在抑制基因表达中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及EIN2蛋白在抑制基因表达中的应用。
【背景技术】
[0002] 在模式植物拟南芥中 EIN2 (Ethylene Insensitive 2)基因（AT5G03280)功能缺 失导致完全乙烯不敏感。这是到目前为止人们发现的唯一的单基因缺失突变导致完全乙烯 不敏感的突变体，说明EIN2蛋白是乙烯反应的正调控组分，也说明EIN2蛋白是乙烯信号通 路的关键组分（Alonso et al.，1999 ;Ji and Guo, 2013) 〇
[0003] 拟南芥EIN2蛋白具有1294个氨基酸，其N端含有12个跨膜结构域（1~461)，负 责将蛋白定位于内质网膜。同时，其C端（462~1294)为亲水区。虽然进化分析表明EIN2 的C端（EIN2CEND)比较保守，但生物信息学分析表明该区域不包含目前已知的任何典型的 蛋白功能结构域（Ji and Guo,2013)。在功能缺失突变体ein2-5中过量表达EIN2CEND，可 以组成型激活乙稀反应；而当过量表达EIN2的N端却并没有组成型乙稀反应。这暗示整个 N端作为一个跨膜结构接受上游的信号，而EIN2CEND参与了乙烯的信号转导并将信号向下 转导（Alonso et al.，1999) 〇
[0004] 近期，有研究表明EIN2蛋白C端的激活乙烯信号转导的一种机制（Juet al.，2012;Qiaoetal.，2012;Wenetal.，2012)。当植物体内存在大量乙烯时，EIN2的 C端因被某种蛋白酶剪切而脱离内质网并进入细胞核并激活乙烯反应（Juetal.，2012; Qiaoetal.，2012;Wenetal.，2012)。除此之外，人们还发现EIN2在细胞质中也有一定 的分布（Qiaoetal.，2012;Wenetal.，2012)，这说明EIN2在细胞质中可能具有重要的 功能，但该功能需要进一步的研究。

【发明内容】

[0005] 本发明目的是提供EIN2蛋白在抑制基因表达中的应用。EIN2蛋白在细胞质中与 EBFlmRNA的3'UTR相互作用，并与EIN5等蛋白互作共同定位于P-body，进而抑制EBFlmRNA 的翻译过程。
[0006] 本发明解决技术问题采用如下技术方案：EIN2蛋白在抑制基因表达中的应用。
[0007] 优选地，所述EIN2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 优选地，所述EIN2蛋白在细胞质中抑制EBFlmRNA到蛋白质的翻译过程中的应用。
[0009] 优选地，所述EIN2蛋白在抑制带有EBFl 3' UTR的报告基因的表达中的应用。
[0010] 优选地，所述EIN2蛋白在获得乙烯超敏感型转基因拟南芥中的应用。
[0011] -种检测EIN2蛋白在抑制基因表达中的功能的方法，包括制备重组基因MlC与 M1F，其中MlF包括依次连接的MYC标签编码序列、EBFl编码序列、EBFlmRNA的3'UTR、重组 基因所转录出的成熟mRNA的PolyA ;M1C包括依次连接的MYC标签编码序列、EBFl编码序 列、重组基因所转录出的成熟mRNA的PolyA ;分别转入野生型拟南芥Col-0、ein2-5突变体 以及EIN2过表达的EIN2ox植株中，进而检测转基因株系体内MYC-EBFl蛋白的水平。
[0012] 优选地，所述方法包括制备重组基因35S: :EIN2-mRFP，所述重组基因为将EIN2 基因与红色荧光蛋白mRFP的编码序列融合，然后将重组基因转入乙烯完全不敏感突变体 ein2-5中获得转基因株系35S: :EIN2-mRFP/ein2-5,筛选获得对乙烯反应与野生型拟南 芥Col-O -致的35S: :EIN2-mRFP/ein2-5株系，对该株系施加外源乙烯，同时对融合蛋白 EIN2-mRFP进行亚细胞定位。
[0013] 本发明提供EIN2蛋白在抑制基因表达中的应用，EIN2蛋白在植物中，特别是高等 植物中表达，首次发现乙烯促进EIN2蛋白在细胞质内形成斑点，并可以抑制任何一个带有 EBFl 3'UTR基因的翻译过程；进而得到，只要把靶基因的编码序列和EBFl 3'UTR融合，然 后通过一定条件表达EIN2就可以在转录后水平打开或者关闭该基因的表达。
【附图说明】
[0014] 图1为EIN2蛋白亚细胞定位；
[0015] 图2为EIN2通过3' UTRT抑制EBFlmRNA的翻译并激活乙烯反应；
[0016] 图3为EIN2与EBFlmRNA 3' UTR、EIN5在体内发生相互作用；
[0017] 图4为EIN2和EBFl 3'UTR抑制基因表达。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步阐述。以下实施例中使用的 试剂和材料均为市售商品。
[0019] 实施例1EIN2蛋白亚细胞定位
[0020] 将红色荧光蛋白mRFP的编码序列与EIN2基因融合，并利用35S启动子构建重组 基因35S: :EIN2-mRFP。然后，利用农杆菌介导的办法将该重组子转入乙烯完全不敏感突变 体ein2-5中，获得转基因株系35S: :EIN2-mRFP/ein2-5。通过抗性筛选和表型分析，获得了 对乙烯反应与野生型拟南芥Col-O -致的35S: :EIN2-mRFP/ein2-5株系，这说明该株系中 的融合蛋白EIN2-mRFP具有与植物内源蛋白EIN2相同的功能。利用该转基因材料并借助 激光共聚焦荧光显微镜，分析在施加外源乙烯时融合蛋白EIN2-mRFP的亚细胞定位。如图 IA所示，转基因株系35S: :EIN2-mRFP/ein2-5在黑暗条件下生长在MS培养基（-ACC)以及 含IOyM ACC的MS培养基（+ACC)上，3天后取材观察红色荧光蛋白的定位。图IA中白色 三角形代表细胞核，白色箭头代表细胞质中的点状结构。ACC是乙烯生物合成的前体，常做 外源施加处理。图IA结果表明，当不存在外源乙烯即植物体内乙烯含量很低时，红色荧光 信号较弱且在细胞内随机分布；而当施加外源乙烯即植物体内乙烯含量很高时，红色荧光 信号增强且明显在细胞核内积累（见图中三角形所示），更明显的是在细胞质内出现明亮 的点状结构（见图中箭头所示）。这说明乙烯信号促进EIN2蛋白稳定且诱导其在细胞核内 积累，这与人们之前的报道相一致（Qiao et al.，2012 ;Wen et al.，2012)。同时，还表明 乙烯促进EIN2蛋白在细胞质内形成斑点，这是以往研究中未见报道的。
[0021] 为了进一步确认EIN2蛋白的亚定位，构建青色荧光蛋白标记的EIN2,即 EIN2-CFP。通过农杆菌侵染介导的瞬时表达体系，在烟草叶片中共同表达了 EIN2-CFP、内质 网膜标记蛋白ER-mCherry、细胞核标记蛋白YFP-NLS，并观察荧光、分析乙烯对于EIN2-CFP 在细胞质内分布的影响。如图IB所示，将分别含有35S: :EIN2-CFP、35S: :ER-mCherry、 35S: : YFP-NLS的农杆菌共同注射到烟草叶片中，恢复生长48小时。之后，再次注射100 y M ACC并于2小时后观察荧光。其中，红色代表EIN2-CFP，绿色代表内质网膜，蓝色代表细胞 核；黄色为红、绿色叠加，紫色为红色、蓝色叠加。结果表明，未施加外源乙烯处理时EIN2主 要是定位在内质网膜上；而当施加外源乙烯处理2小时之后烟草叶片叶肉细胞的细胞质内 便出现点状结构，这些点状结构在细胞内散状分布，由此说明乙烯诱导EIN2蛋白脱离内质 网膜并在细胞质内形成点状结构。
[0022] 上述施加外源乙烯处理时EIN2蛋白所形成的大小不一、散状分布的点状结构与 一种称作processing body (P-body)的亚细胞结构非常像，其为真核细胞中mRNA翻译抑 制和降解的场所，人们利用免疫荧光研究酵母中负责mRNA降解的Xrnl时发现，该蛋白定 位在细胞质中且以点状结构存在（Decker and Parker, 2012)。于是，本实施例中选取拟南 芥中的同源蛋白AtXRN4/EIN5,并使其与EIN2在烟草中共表达，如图IC所示，将分别含有 35S: :EIN2-mRFP、35S: :EIN5-CFP的农杆菌共同注射到烟草叶片中，恢复生长48小时。之 后，于含IOOppm乙烯的空气中放置2小时后观察荧光。红色代表EIN2,绿色代表EIN5,黄 色代表二者叠加。结果显示，乙烯诱导EIN2与EIN5在细胞质中共定位，且形成明显的点状 结构，这表明乙烯促进EIN2蛋白参与形成P-body。
[0023] 实施例2EIN2通过3' UTRT抑制EBFlmRNA的翻译并激活乙烯反应
[0024] 中国专利ZL201110110101.0中已经公开了 EBFlmRNA 3'UTR作为一个顺式作 用元件能抑制由mRNA到蛋白的翻译过程，该3' UTR在EBFlmRNA的翻译过程中起负调作 用。从遗传关系上讲，EIN2是通过负向调节EBF1/2的功能而激活下游乙烯信号的（An et al.，2010 ;Guo and Ecker，2003)。本实施例检测作为参与形成翻译抑制结构P-body的 EIN2蛋白是否具有调控翻译的功能。
[0025] 由于缺乏特异针对内源EBFl蛋白的抗体，本实施例将MYC标签编码序列与EBFl 蛋白编码序列（即Coding Sequence,简称⑶S)重组在一起，这样就可以用商业化的MYC 标签抗体来检测MYC-EBFl蛋白水平；构建一个"长版"的EBFl重组基因，即在MYC-EBFl 序列后面融合了 EBFlmRNA的3' UTR序列，且以翻译终止密码子TGA相隔，将此重组基因命 名为MlF(MYC-EBFlFull-Iength);同时，构建一个"短版"的EBFl重组基因，该重组子没有 3'UTR，命名为MlC(即MYC-EBF1CDS)，如图2A所示，重组基因MlC与MlF结构示意图，其中 左侧依次表示MYC标签编码序列、EBFl编码序列（coding sequence，简称CDS)、重组基因所 转录出的成熟mRNA的多聚腺嘌呤尾巴（PolyA);右侧依次表示MYC标签编码序列、EBFl编 码序列（coding sequence，简称 CDS)、EBFlmRNA 的 3'非翻译序列（un-translated region， 简称3'UTR)、重组基因所转录出的成熟mRNA的多聚腺嘌呤尾巴（PolyA)。箭头表示用于检 测MYC-EBFl转录本时引物所在位置。重组基因MlC与MlF均为35S启动子驱动。
[0026] 如图2B和2C所示，得到重组基因之后，将重组基因MlC与MlF分别转入野生型 拟南芥Col-0,通过杂交获得在ein2-5突变体以及EIN2过表达转基因株系EIN2ox背景 下的植株中。以野生型拟南芥Col-O为背景利用转基因技术，获得了多个可稳定遗传且为 单拷贝插入的转基因株系MlC/Col-0和转基因株系MlF/Col-0 ;通过杂交获得了在突变体 ein2-5 和 EIN2 过表达转基因株系 EIN2ox/ein2-5 背景的株系：MlC/ein2-5、MlC/EIN2ox、 MlF/ein2-5、MlF/EIN2ox。继而，检测上述株系体内MYC-EBFl蛋白的水平